杂交

互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。

多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。

杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。

由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。

由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：

1. Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb Hybridization Solution和GlassHyb Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。

7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
　　8016-1 GlassHyb Hybridization Solution 50ml

2. Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在 这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。

8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
　　8015-2 ExpressHyb Hybridization Solution 500ml

3. 对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。

由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。

毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion 同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。

Cat.No. Product Name Size
　　1860 SlideHyb™GlassArray Hybridization Survey Kit 100rxns
　　8861 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
　　8862 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
　　8863 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
　　8864 SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
　　10040 Glass Array Hybridization Cassette 1 each

4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray (Ambion), Atlas(Clontech)，LifeGrid (Incyte Genomics), GeneFilter (Research Genetics), and Panorama (Sigma-Genosys) arrays等产品验证。

Cat# ProductName Size
　　7118 Yeast RNA 10 x 10 mg/ml
　　8665 ULTRArray™ Hybridization Buffer 225 ml
　　8666 ULTRArray™ Hybridization Buffer 500 ml
　　8667 ULTRArray™ Low Stringency Wash Buffer 1 L
　　8668 ULTRArray™ High Stringency Wash Buffer 1 L
　　9680 Salmon Sperm DNA (sheared) 10x10 mg/ml
　　9763 20X SSC 1 L
　　9765 20X SSC 4 x 1 L
　　9780 RNaseZap™ 250 ml