【共享】Nat methods：解析长链非编码RNA的新技术c-KLAN

尽管当前有多种方法可用于全面研究蛋白质编码基因的细胞内作用，然而用于系统研究与多种生物学信号通路有关的长链非编码RNAs (lncRNAs)的技术却十分有限。在这篇文章中，来自德国德累斯顿工业大学的研究人员开发了一种结合非编码RNAs敲除和定位分析的技术，称之为c-KLAN。利用这一技术对lncRNAs进行了功能鉴定和定位，并鉴别出了调控小鼠胚胎干细胞类型的转录物。

在真核生物基因组中大量的蛋白质编码和非编码转录物被转录，然而直到近年来后者才获得广泛的科学关注。LncRNAs是一类非蛋白质编码转录物，长度在几百bp到几kb之间。 众所周知其参与了多种生物学过程，例如X-染色体失活、染色质水平的表观遗传学状态调控、胚胎干细胞状态维持、转录调控以及疾病状态调控等。尽管利用标记和成像技术结合功能缺失研究已成功地应用于大量的蛋白质编码基因研究中，却还没有关于长链非编码转录物显像和表型特征鉴定的类似方法被报道。核酸内切酶切割制备的短干扰RNAs（esiRNAs, endoribonuclease prepared short interfering RNAs）已被证实更加适合于RNAi筛选，因为它们能够有效地敲除靶向转录物，又避免了天然复杂的siRNAs的显著脱靶效应。研究人员认为相同的优势同样适用于沉默lncRNAs。在这篇文章中，研究人员构建了一个能靶向594种lncRNAs的esiRNA文库，在小鼠细胞中进行了功能缺失筛查。同时，研究人员还改良了esiRNA合成方法，实现了无缝、可再生合成特异性探针检测了细胞中lncRNAs的定位。

步骤：

对lncRNA序列进行DEQOR优化和经由电脑模拟设计引物，随后对cDNA进行PCR扩增，完成对PCR扩增产物的测序和定量检测。

接下来一方面通过体外转录PCR扩增产物生成dsRNA，然后利用Rnse III酶切就生成了可用于IncRNAs功能缺失研究的esiRNA文库。

另一方面可利用链特异性RNA聚合酶和荧光标记UTPs对PCR进行体外转录，即可生成正义或反义探针。

然后采用FISH技术对IncRNAs进行定位分析。

利用c-KLAN研究了Panct1在小鼠ESCs中的作用
研究人员利用c-KLAN揭示了小鼠胚胎干细胞中转录物Panct1的定位和功能。证实Panct1主要定位于细胞核中，其在ESC状态维持中发挥着关键性的作用。
lncRNA生物学的快速发展需要对这些转录物进行深入的检测，但由于转录组的复杂性和适当注解的局限性很难对这些转录物进行标记。在此项研究中，科研人员介绍了一种组合方法可大规模地对lncRNAs进行定位和功能分析。c-KLAN为我们提供了一种快速、简便和可靠的途径检测lncRNA介导的各种细胞过程的调控。

(生物通：何嫱）

Combined RNAi and localization for functionally dissecting long noncoding RNAs

Nature Methods (2012)
doi:10.1038/nmeth.1894
Received 21 June 2011
Accepted 11 January 2012
Published online 12 February 2012

Whereas methods to comprehensively study cellular roles of protein-coding genes are available, techniques to systematically investigate long noncoding RNAs (lncRNAs), which have been implicated in diverse biological pathways, are limited. Here we report combined knockdown and localization analysis of noncoding RNAs (c-KLAN) that merges functional characterization and localization approaches to study lncRNAs. Using this technique we identified transcripts that regulate mouse embryonic stem cell identity.

Figures at a glance

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