胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

一、细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。

2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。

3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。

5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。

二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。

贮存液

DMEM(高糖)

马血清（HS）

L-谷氨酰胺（200M）

MEMNEAA（10M）

HEPES（1M）

?-巯基乙醇（55M）

PEST

ESGRO

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤

1．从液氮中取出一管细胞；

2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3．将细胞转移到一15Fn管中；

4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5．离心3分钟；

6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；

8．孵育。