实时定量PCR方法对水中细菌RNA进行精确定量

实时定量PCR 方法对水中细菌RNA 进行精确定量

Applied and Environmental Microbiology, June 2004, p. 36183623
Axel Fey,1 Stefan Eichler,1 Se´bastien Flavier,2 Richard Christen,2 Manfred G.

摘要

定量PCR （Q－PCR ）是一种对目的基因定量的快速高效的方法。在真核细胞里，定量－反转录－PCR （Q－RT－PCR ）也在采用稳定表达的看家基因做参照的情况下用于基因表达的检测。在细菌体内，由于不存在稳定表达的看家基因，因此只有选择合适的RNA 标准品才能对菌体内的RNA 进行准确定量。

本文建立了一种不仅能定量目的基因拷贝数（如细菌细胞数目），还可确定RNA 拷贝数的精确定量方法，并用编码伤寒沙门氏菌invA 和16S rRNA 的基因来对该方法做出评价。

目的基因的扩增片段用来做DNA的标准品，而同样的DNA标准品在体外转录用来做合适的RNA 标准品，接种沙门氏菌的培养基和环境水样被用来做最终的检测。结果表明，运用Q－PCR 和Q－RT－PCR 法均能对目的基因和RNA 分子进行灵敏、精确、高重复性的定量。

这是RNA 标准被首次运用到原核生物的精确定量，表明这是一种对环境样品致病菌的存在性和代谢活性分析的新型检测方法。

前 言

水源中病源微生物的存在情况与人类健康息息相关（21，28）。传统的细菌培养检测方法不仅耗时，而且无法确定细菌的存活情况；PCR 方法的应用便使上述问题得到了解决，并由此发展出多种针对水体病源微生物的检测方法（7，9，13）。

但由于DNA在病原体死亡后还有很长的存在期，由此会造成假阳性的结果，因而在确立鉴定目的基因存在与否就代表细菌存在与否这个问题上就出现了争议（6）。因此，监测相对不稳定的RNA 样本就成了另一个更为有效的方法（20）。

实时定量PCR （Q－PCR ）和反转录PCR （Q－RT－PCR ）可以对基因、基因产物、甚至环境样品进行有效定量（16，24）。然而，由于缺乏可靠的参照，RNA 精确定量的发展受到了局限。在真核细胞内，稳定表达的看家基因（如β-actin）可用作基因表达的相对定量的标准。

遗憾的是，在细菌体内，还没有发现上述可稳定表达的基因。一部分人认为，可以选取16SrRNA 的总量作为功能性基因表达的参照（12，14）。然而，rRNA 的表达是和细菌的生理状态相关的（5，18）。

当我们检测一系列环境样品的基因表达情况时，细菌的生理状态（如每个细胞16SrRNA 的表达水平）是完全未知的。并且，这种方法无法对目的基因拷贝数进行准确定量。另一部分人则认为，可采用基因组DNA或包含基因组DNA片断的质粒作Q－RT－PCR 的参照（17，22，23）。

然而，使用DNA作为标准品没有考虑到在反转录这一步中反转录效率的问题，而这一步会导致反应的效率与真实值相比会降低了84%-98.6%。因此，采用DNA作参照标准往往会低估实际的靶分子含量。真核细胞可采用细胞内转录的RNA 作参照避免上述的情况，而细菌也需要找到一种类似的方法去解决这个问题。

我们研究的目的就是为了寻找一种能对环境水样中病菌基因和RNA 样本进行准确定量的分析方法。以沙门氏菌为模式生物，将invA 和16SrRNA 的编码基因作为目标基因，并采用在无菌的培养基或水样中接种进行验证。

结果首次表明，体内转录的RNA 标准品能成功地用于细菌内RNA 的拷贝数的准确定量。这种以Q－PCR 为基础的方法便能够对环境水样中病原体微生物的存在及代谢活动做出灵敏而准确的评估。