含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化操作指南！

一、用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因

所需特殊试剂：1M IPTG

1. 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的 LB 平板，37℃ 培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。

2. 分别挑取对照菌和重组菌 1 个菌落，接种于 1 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中，37℃ 通气培养过夜。

3. 取 100 微升过夜培养物接种于 5 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中（各 10 份），适当的温度（20－37℃）震荡培养 4 小时，至对数中期（A550＝0.1 - 1.0）。

4. 对照菌和重组菌各取 1 ml 未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mM 相同的温度继续通气培养。

5. 在诱导的 1，2，3，4，5 个小时取 1 ml 样品于 Ep 管中。

细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG 的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。

6. 将所有样本室温最高速度离心 1 分钟，弃上清，沉淀重悬于 100 微升 1×SDS 蛋白上样缓冲液中，100℃ 加热 5 分钟，室温最高速度离心 1 分钟，取 15 微升样品上样于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，用 SDS－PAGE 观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。

二、大量表达靶蛋白

1. 取保存的重组大肠杆菌菌液 150 微升接种于 30 毫升含相应抗生素的 LB 培养液中，在 100 毫升锥形瓶中，300rpm，37℃ 通气过夜培养。

2. 取 16 毫升过夜培养物接种于 800 ml 含相应抗生素的 LB 培养液，在 2L 的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养 4 小时，至对数生长中期。

3. 以预实验确定的最佳 IPTG 浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。

4. 收集菌液，4℃，5000 g（5500rpm）离心 15 分钟收集沉淀，－70℃ 保存。

三、细菌破碎和蛋白质溶解

所需特殊试剂：

非变性裂解液：50 mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑，pH8.0

超声破碎液：50 mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl , pH8.0

1. 每 200 ml 菌液离心所得沉淀以 10 ml 非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度 1 mM。

2. 超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间 5 秒，间隙时间 5 秒，总时间 20 分钟（破碎时间一般不宜超过 10 分钟，菌量不超过 1 g）。整个超声过程中探头离烧杯底部 1 厘米为佳，烧杯置于冰浴中。

3. 超声破碎后，取 1 滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。

4. 将细菌破碎液以 10000rpm，30 分钟，4℃ 离心，收集上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。

5. 分别取 10 微升上清和沉淀重悬液用于 SDS-PAGE 检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于－70℃ 保存。

四、Ni-NTA 亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略

（一）若为上清表达

所需特殊试剂：

非变性裂解液：50 mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑，pH8.0

Wash buffer：50 mM NaH₂PO₄ , 300 mM Nacl ,20 mM 咪唑，pH8.0

Elution buffer：50 mM NaH₂PO₄ ,300 mM Nacl ,250 mM 咪唑，pH8.0

1. 离心后上清蛋白与 Ni-NTA 混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇 1 小时，使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用 0.4 微米微孔滤膜过滤。

2. 将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6 秒/滴），收集流出液体。可以取样进行 SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。

3. 用 Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的 50－100 倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。

4. 用 Elution buffer 洗柱，用 1.5 mLEP 管收集洗脱液，直至 A280<0.1。

5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的 A280，选择 A280 变化明显的管取样进行 SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。根据 A280 和电泳图选择合并 A280 相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使用超滤的办法 。收集的蛋白- 20℃ 保存。

说明：只经过 Ni-NTA 纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施，比如 DEAE, 分子筛，疏水层析等。

（二）若为包涵体表达

所需特殊试剂：

细胞裂解液：50 mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X- 100, pH 8.0

变性裂解液：10 mM NaH₂PO₄ ,10 mM Tris-Hcl，8M 尿素，pH8.0

复性液： 100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris-Hcl，2 mM 还原型谷光甘肽，0.2 mM 氧化型谷光甘肽

Wash buffer: 100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris-Hcl，pH6.3

Elution buffer: 100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris-Hcl，pH4.5

1. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心，去上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4℃ 细胞裂解液，每克菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，悬液室温放置 5 分钟，4℃，12000rpm×15 分钟。洗涤 5 次。

2. 每克沉淀重悬于 9 ml 含 0.1 mM PMSF，10 mM 2 -巯基乙醇，2 mM 还原型谷光甘肽和 0.2 mM 氧化型谷光甘肽的变性裂解液中，调节 pH 在 10.7，室温放置 60 分钟。

3. 再用盐酸调 pH 至 8.0，室温放置 30 分钟。

4. 4℃，12000rpm×15 分钟离心，留上清待用。沉淀重悬于 100 微升 1×SDS 蛋白上样缓冲液中。取 10 微升上清加 10 微升 2×SDS 上样缓冲液，上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE，分析溶解程度。

5. 稀释透析复性：每毫升上清缓慢加入 9 毫升 6M 尿素的复性液中。装入经 10 mM NaOH 和 1.0 mM EDTA 煮沸 30 分钟，蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在 4℃ 10 倍以上体积含有 2M 尿素的复性液中透析 5 个小时。

6. 取出透析袋，再放入 4℃ 10 倍以上体积的复性液中透析过夜。

7. 取出透析袋中的蛋白，测定其 A280，加入相应体积的 Ni-NTA 树脂混匀，按与上清纯化相同的方法上柱纯化，但是 Wash buffer 和 Elution buffer 用包涵体纯化的 pH 递减的缓冲液。

五、Ni-NTA 树脂的再生

当 Ni-NTA 琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色，此时 Ni-NTA 树脂需要再生后才能使用。

所需试剂：

再生缓冲液：6M 盐酸胍＋0.2M 乙酸

2%SDS（m/V）

25%，30%，50%，75% 的乙醇（V/V）

100 mM EDTA，pH8.0

100 mM NiSO₄

裂解缓冲液 A：

10 mM NaH₂PO₄ + 10 mM Tris-Hcl + 6M 盐酸胍，pH8.0

裂解缓冲液 B：

10 mM NaH₂PO₄ + 10 mM Tris-Hcl + 8M 尿素，pH8.0

1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱：

• 2 倍柱体积的再生缓冲液

• 5 倍柱体积的双蒸水

• 3 倍柱体积的 2%SDS

• 1 倍柱体积的 25% 的乙醇

• 1 倍柱体积的 50% 的乙醇

• 1 倍柱体积的 75% 的乙醇

• 5 倍柱体积的 100% 的乙醇

• 1 倍柱体积的 75% 的乙醇

• 1 倍柱体积的 50% 的乙醇

• 1 倍柱体积的 25% 的乙醇

• 1 倍柱体积的双蒸水

• 5 倍柱体积的 100 mM EDTA

• 1 倍柱体积的双蒸水

• 2 倍柱体积的 100 mM NiSO4

• 2 倍柱体积的双蒸水

• 2 倍柱体积的再生缓冲液

2. 2 倍柱体积的适当的裂解缓冲液（A 或 B）平衡 Ni-NTA 树脂

3. 将再生后的 Ni-NTA 树脂按 1：1 的比例保存在 30% 的乙醇中