（交流）关于免疫组化的东西

　　免疫组化技术是在抗原抗体特异反应存在的前提下，借助于免疫细胞化学的手段，检测抗原（或抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术。其原理是利用免疫的核心——用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测。，近20年来，由于单克隆抗体生产技术的不断进步，检测系统的改进以及抗原修复方法，特别是热处理方法在福马林固定的石蜡切片上的应用，免疫组化技术有了飞跃性的进展。加上近年来在应用方面积累的经验，使得免疫组化技术已成为医学研究及协助临床诊断上重要的一门技术。。
1兔疫组化技术的进展
1.1检测技术的进展
自1941年Coons及其同事发表免疫荧光技术至今已有半个多世纪，随后免疫组化技术也逐步发展、检测技术的进步主要表现在敏感性的提高，以及特异性增强，即可使用较少的抗体检测出针对性的抗原，而又有极少或没有非特异性背景呈色。此外，整个免疫染色时间也更加缩短。这主要表现在以下几方面：
1．1．1 检测步骤
由直接法走向间接法。包括大家熟悉的一般间接二步法、PAP法、ABC法、LAB－SA法，现在大家认为以LAB-SA法最为优越。目前曾有将多聚体氧化酶直接连接在第一抗体上，用直接法染色，敏感度也大大提高。但毕竟存在有每一单个一抗都需做酶标记，以及对核抗原效果不好的缺陷。
1．1．2 标记物
有荧光素、酶、胶质金等。近年来，在荧光素方面除过去常用的FITC，TRITC外，尚有Phycoerthsin，Cy3，Cy5，Cy2等荧光素，新出现的这些荧光素具有荧光更强，封片后不易褪色的特点，或是与其他荧光素可用相似波长的滤光片组合以激发荧光，但颜色不同，更有效地进行双重染色。在胶质金作为标记物方面，使用银加强剂，可使用较小的胶质金标记（一般用3～4nm）二抗，经银加强剂及显示棕黑色或黑色，大大增强了敏感性。在酶标记方面，则仍以辣根氧化酶及碱性磷酸酶为常用。
1．1．3 标记技术
近年来，由于生化技术的进步，免疫组中个别试剂的质量也大有提高，包括二抗的亲和力，标记物的质量等，从而大大提高了检测系统的灵敏度。例如，LAB－SA系统，由于生物素标记二抗，酶标链霉亲生物素蛋自（HRP－Stseptavidin）新技术的使用，使得Zymed第二代LAB－SA产品，即 Histoplus－SP检测盒比现在广泛使用的Zymed第一代LAB－SA产品，即Histostain－SP检测盒，在敏感度上提高2～4倍，同样有非常清晰的背景染色。使得一些很难测到的、含量极少的抗原得以显示，或使抗原使用量大大减少，或是在同一抗体浓度下，大大增强了特异性染色（如ER，PR,Ki-67等）。又如，DAKO的Envision系统，由于将二抗体连接在氧化酶多聚体上，增加了酶分子数量，从而提高了敏感度。其缺点则是多聚体酶与二抗结合后，其分子量很大，难于穿透到细胞内，因而对检测核抗原时敏感性反而有所降低，或效果不稳定。在胶质金标记技术上也有很大提高，加上银加强剂的使用，其敏感性也大大增强了．
l．1．4 其他方面
单一的、不必在使用前新鲜配制的即用型稳定AEC显色剂，以及DAB溶液Zymed也已研制成功，大大方便了使用者。另外，将免疫金检测技术与荧光相结合，即是将已经免疫金染色的切片，用特殊的滤片组合激发出的荧光在荧光显微镜下观察，可大大提高其敏感性。有些在一般酶标法或胶质金标法染色后，在光学显微镜下无法看到的染色，经胶质金染色后、荧光激发后，可在荧光显微镜下清晰见到。
1．1．5 检测方法的比较
免疫金法加荧光虽最敏感，但操作中注意事项较繁琐。如容器要非常干净，试剂不能有丝毫污染，银加强剂加入后时间严洛控制等、因此，只适合于研究用，不能用于大量的临床标本。目前仍以LAB－SA法最适用，尤其是Zymed第二代产品，Histoplus－SP检测盒较好。
1．2 抗体制备技术的进步
自从利用杂交瘤技术制备单克隆抗体以来，为免疫组化开辟了新的前景。近年来，抗体制备技术的进一步发展，更使得免疫组化技术得以更广泛地推广应用。本文不涉及用基因工程直接制备抗体的技术，因为用此先进技术制各抗体尚需相当一段时间的改进与完善，才有实际应用价值．利用DNA基因库结合电子计算机程序算法来设计免疫原并制备抗体的新技术，正是这种制备技术的发展、扩大，才加速了免疫组化技术的进展。
近10年来，利用合成肽技术在基础科学与临床研究上的应用已有报道。随着分子生物学技术的进步，对细胞或组织的蛋白质可分析出其氨基酸序列，井纳入基因库．然后恰当地选择一定部位的肽链作为免疫原以生产抗体。这种抗体制备技术有着特异性强，制备时间短等特点。
1．2．1 免疫原氨基酸序列的选择
这是制备新抗体的关键．由于生物科技与计算机技术的飞跃发展，现在我们可以用电子计算机查阅各神抗原氨基酸序列，井用计算机程序算法预测其各部段肽链的亲水性、表面可及情况（access比insurface probabilvties）、抗原性、结构可塑性（regims q flexi－bility）、以及其二级结构情况等，以选择最合适的免疫原肽链部位。
1．2．2 免疫原肽链的合成选择好合理的免疫原氨基酸序列之后，则可以按此序列人工合成肽链而作为免疫原以制备抗体。目前常用的两种制备合成肽免疫原的方法，一是多抗原性肽链合戍（multinle antigenic peptide，MAP）。即将选择好的同一序列的肽链，4～8条连接到正至数个赖氨酸组成的核心上。这样，增大了作为半抗原的小肽链的结构，使其成为大分子的免疫原。另一种是将选择好的肽链合成后，再与一大分子携带蛋白连接以成为免疫原。通常使用的携带蛋白为KLH或BSA。豆．23制备抗体一般来说，上述两种合咸肽免疫原均可用来免疫动物制备免疫血清（多克隆抗体）或单克隆抗体。但根据我们经验，对于某些特定抗原，特别是与动物本身自体相类似的抗原族来说，仍以有携带大分子蛋白的合成肽作为免疫原为首选。近年来，Zymed已发展了一套快速多克隆抗体（免疫血清）生产程序。从选择合理氨基酸序列到合成肽链，制备肽链免疫原到免疫动物井初步生产出抗血清以作鉴定，全程只需30～45天。叫做Polyquk系统，这样就加速了特异性抗体的生产与试用。
Zymed由于应用了以上技木，目前巳生产出质量很好的PR（黄体酮受体）的单抗及多抗，Ki－67的单抗及多抗，以及其他众多的分子生物学上使用的有关信号传播系统的抗体。
1．3 抗原修复技术的发明
过去，由于有些抗体只能用于冰冻切片，而不能用予福马林固定的石蜡包埋切片，从而限制了免疫组化技术在研究上与临床上的应用。近年来，由于对福马林固定的石蜡包埋切片上抗原修复方法的进展，使免疫组化技术的应用有了很大的突破。
1．3．l 酶修复方法在进行免疫组化染色前，用酶作预先处理，以暴露被掩盖的抗原。应用的酶种类繁多，如Ficin，Trypsln，P，psln，Pronase，Protease等。不同抗原需用酶的种类也可能不同，不同实验室应用酶的种类、浓度、作用时的温度与时间均有不同．Zymed公司为了使用者的方便，配制了酶消化修复抗原的组合，即把Ficin，Trypsin，Pepsin配制成一定浓度，即用型的稳定溶液。在37℃下培育10分钟以修复抗原。使用者如需要进行抗原修复研究，可分别将此3种酶溶液加在切片上，在37C下培育10分钟作预处理，以选择最好的酶对该抗原进行修复。Zpoed公司对其所生产的各种抗体均有进行此项研究，并列表指出所有抗体是否需抗原修复，如需修复，何种酶为最佳选择，也包括需要用热处理者。
1．3．2 热处理法酶修复抗原法虽扩大了免疫组化染色的应用，但仍有些抗原经酶处理后仍未能获得阳性染色结果。过去常被解释为这些抗原系在组织固定或包埋过程中被破坏。1991年Shi氏等‘”发表了用微波炉方法修复抗原，使得更多抗原得以修复，使免疫组化染色技术得以迅速扩大应用。嗣后数百篇文章又相继发表，初步认识到微波炉法的实质系用加热至沸，在一定PH值的不同缓冲液中，使醛基交联网络的肽键断裂以暴露抗原决定簇，从而把此类修复方法称为热导致抗原修复法（ heat induced evitone y，HIER）。虽然在多项研究中，使用了不同加热方法，包括微波炉、高压锅、一般煮沸、高压消毒器等等；也曾使用不同PH值的各种缓冲液，从硫氰酸铅、枸橼酸缓冲液、Tris缓冲液、脉、EDTA、甘氨酸盐酸溶液，直到一般蒸馏水等，但比较一致的看法仍认为温度是最主要的关键。Shi氏等在其最初的报告中，系使用硫氰酸铅溶液以微波炉加热作抗原修复，主要有下列几点不尽人意：一是缓冲液蒸发时具有毒性；二是在微波炉加热10分钟过程中，由于液体的蒸发，常使缓冲液液量减至使切片上的组织无法浸泡在液体中，故需1～2次取出补充足溶液量。此外，浸泡切片的容器需放置在微波炉中心，否则会影响效果。这些都使得使用不方便或结果不稳定。因此，许多研究者都看重在加热方法及缓冲液上进行进一步研究。根据现有材料来看，在加热方法方面，有以下几种方法可制取。①置入微波炉中加热15分钟。②直接煮沸，经煮沸起算15分钟。③用有温度控制的微波炉，使温度维持在92℃～98C之问（不使其煮沸，以免水分蒸发）15分钟。至于缓冲液，一般以0.01M枸橼酸盐缓冲液即可。而当有些抗原修复不理想时，则可试用PH1．0与PH10．0的0.01M Tris缓冲液分别再进行测试，以选择最优者。
在进行热处理中有一点应强调的是：任何方法都需把切片先放入冷的，即室温下的缓冲液中，然后逐渐加热煮沸后起算10～15分钟。停止后仍应把切片留在原有存器中，待其冷却15分钟再取出切片进行进一步免疫染色。高压锅加热当然应遵循高压锅使用原则，以防危险。
还需指出的是，并不是所有抗原修复都可使用热处理方法，有的抗体用酶处理才行。例如某些鼠单抗，抗8因子相关抗原，抗胶原素IV，上皮细胞生长因子受体（EGFR）等，热处理反使抗原破坏，而用酶处理则取得良好效果。因此，对新抗体使用而考虑进行抗原修复时，可先用不同酶处理进行测试，如结果不理想，则可用热处理法。另外，一般而言，核抗原，或神经系，神经内分泌系统抗原常需使用热处理进行抗原修复，或加强免疫染色于福马林固定的石蜡切片上。
1.4 结语
近年来，由于检测技术敏感性的不断增强；单克隆抗体的制备；基因库的建立及电脑程序算法的设立（用来选择特异性肽链，并通过合成肽免疫原生产更特异的抗体）；以及修复抗原性的各种措施、特别是热预处理法的出现与发展，使得免疫组化技木的使用迈出了崭新的一步。至于自动化免疫检测系统，原位杂交技术及PCR原位杂交技术在组化技术的应用等进展还有待研究。