OD260/OD280比值的问题
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DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断,符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。
一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发。
纠正一下,纯DNA的A260/A280应大于1.8,纯的RNA应达到2.0,样品中如果含有蛋白质及苯酚,A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品,只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA,或者40微克/ml 单链DNA(RNA),或者20微克/ml 寡核苷酸计算。
吸光度:吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数,影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来,同一种物质,吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质(通常为溶液)时,溶质吸收了光能,光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值,而OD是光密度值,一个意思。
少量异硫氰酸胍(132 uM)残留使A230变大,但A260,A280几乎不变,所以A260/A280仍在2左右,而A260/A230大大低于2。大量异硫氰酸胍(2.4 M)残留使A230,A260,A280均变大,根本就没有办法测定了。PEG(6.25%)残留使A230,A260,A280均变大,但对A230,A260影响更大,所以A260/A280比2大不少,而A260/A230仍在2左右。
2. 苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。
3. 多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4. 设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1~0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10 mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
比值低可能有蛋白污染,高了可能有DNA污染,建议你抽提的RNA分三管,两管保存,另一管用来跑胶和测定OD,跑胶是最直观的,1%的胶就可以,抽提后马上跑,一般不会降解很多,所以设备材料不需要去酶处理不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测,这样就会上来了。