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原理

乙酰胆碱作用于豚鼠回肠的M受体,引起肠肌收缩,当加入M 受体拮抗剂阿托品后,若提高乙酰胆碱浓度,仍能达到未加拮抗剂前的最大反应,并可使剂量反应曲线平行右移,则表明阿托品对乙酰胆碱呈竞争性拮抗。乙酰胆碱用摩尔浓度表示,按质量作用定律,量-
效关系呈直方双曲线,符合Clark 方程式线形关系,可以用Scott 比值法的直线回归运算。pA2是拮抗参数(antagonism parameter),表示竞争性拮抗剂作用的强度,其值越大说明拮抗剂的作用越强。pA2的概念是:能使激动剂的浓度提高到二倍时产生原来的效应(即50 %的最大效应,或50%的受体被激动剂占领)所需拮抗剂摩尔浓度的负对数,pA2 = -log[I]= -logKI

材料与仪器

豚鼠
M Atropine M ACh
BL-420生物采集处理系统 张力传感器 保温式麦氏浴槽 超级恒温水浴 “L”型通气钩 高位吊瓶 量筒 烧杯 培养器 氧气瓶 外科剪刀 眼科剪刀 眼科镊子 缝衣针 棉线 注射器 台式营养器

步骤

一、首先调试BL-420生物采集处理系统,使进入肌张力测定状态.

1.  在主菜单中用鼠标选择〈实验〉中的〈消化〉,选择系统显示<平滑肌生理特性>。

2.  在界面右侧控制参数区选择〈张力〉,〈选择3 g〉,扫描速度1.0 s/div,确定信号输入,选择〈通道2〉,在工具菜单选择快速归零(空载时钩上无任何东西)。

3.  在主菜单中选择〈示波〉,进入示波状态。

4.  在主菜单中工具栏选择〈网格切换〉对背景网格进行切换为细格,并在选项中选择波形颜色红色。

二、调节仪器:

麦氏浴槽中加50 ml 台氏液,调节温度38 ℃±0.5 ℃ ;氧气2~3个气泡/秒,并制备豚鼠回肠标本。

三、正式实验:
1.  将肠管标本两端用缝衣针各穿一线,一端打一空结(约l cm 小套),另一端穿上长线打结,用眼科镊钳住空结固定于通气钩上,放入麦氏浴槽中,将另端长线的尽端打一空结,挂在张力换能器的小钩上,调节换能器高度,使前负荷为1 g,稳定标本20 分钟。

2.  在主菜单下按键选择〈记录状态〉,先描记一段正常曲线,然后按下列顺序给药。

(1)向麦氏浴槽中加入3×10-3 M ACh 0.1 ml,观察曲线变化,检查肠管是否有兴奋作用,然后冲洗肠管,使其恢复至正常。

(2)按表1 所给的剂量累积加乙酰胆碱,制作乙酰胆碱的累积量效曲线。具体作法:先加小剂量ACh,若有反应则当反应达最高峰时立即加下一剂量ACh,在每加一次药时都需用标记,只标加药序号,不打药名,直至曲线上升至最高峰不再升高为止。将系统转入“示波状态”,用台氏液冲洗肠管3遍,稳定标本15 分钟,使恢复至正常。

(3)在主菜单下选择〈记录状态〉,向浴槽中加3×10-3M Atropine 0.1 ml,并标记药名,过1 分钟后再一次制作Ach 的累积浓度量效曲线。

3.  在主菜单下选择“结束实验”。激活工具栏,系统进入分析状态。

表1 Concentration of Ach


四、结果

1.  在主菜单下分析项可选择区域测量、标记查询、开始反演、鼠标捕捉,测量后按工具栏中取消标志线,分别测出正常曲线及每次加药后的张力大小,最后以乙酰胆碱引起最大收缩力为100%,分别计算各剂量反应的百分率


2.  再以各剂量反应的百分率为纵坐标,以剂量的负对数为横坐标,绘出剂量反应曲线。

3.  再根据公式求出pA2值。pA2= log (B/A –1)-logC

A:在无阿托品时,引起最大反应的50%时所需乙酰胆碱的浓度。

B:在阿托品存在下,引起最大反应的50%时所需乙酰胆碱的浓度。

C:为拮抗剂阿托品的浓度。

注意事项

1.  由小分子药物与大分子受体的结合是分子间的相互作用,受体动力学研究中激动剂(ACh)
和阻断剂(阿托品)应该用克分子浓度(mol/L)。

2.  体组织实验应特别注意以下环节:

(1)组织标本制备应轻巧,避免牵拉、压迫;

(2)生理溶液的配制应十分准确;

(3)实验中注意浴槽内温度恒定,并注意浴槽内不断给予气体,有条件者可给予95 %的O2和 5%的CO2

(4)待组织收缩反应平衡后,再开始实验。

3.  实验中以累加方式给药,每次给药后不冲洗标本

4.  切勿随意改变生物信号处理采集系统的实验参数设置。

常见问题

一、说明竞争性受体拮抗剂和非竞争性受体拮抗剂对激动剂的量效曲线的影响?

二、简述pA2的概念和意义。

来源:丁香实验

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