分离细胞浆和细胞核蛋白全攻略

DXY网友qingraner问：本人核浆分离做了最少两个月了吧，似乎没有什么进展，我想请问高人指点一下。我很想知道我的配方有什么问题，或者是我的操作有什么需要注意的地方。十分感谢！还有，我检测的方法是用Ikb-α（标细胞质）和Oct-1（标细胞核），似乎抗体也不是很好用。我做的是BT474细胞，breast cancer cell。

我的方法如下：

1、用Buffer A 洗涤

2、500G离心5分钟

3、用BufferA+B（2：1）裂解细胞，轻轻混匀，孵育5-10分钟

4、12000G离心10分钟（上清：细胞质。沉淀：细胞核和细胞膜）

5、PBD洗涤细胞两次，12000 G离心10分钟

6、Buffer C裂解细胞膜（放入液氮中快速冷冻，在冰上融化10分钟）

7、12000G离心10分钟（上清：细胞核。沉淀：细胞膜）

8、用PBS洗涤

9、用PRPA Buffer在冰上放置30分钟

10、12000 G离心10分钟（上清：细胞膜）

BufferA：10 mmol/L Hepes 7.5；10 mmol/L kcl；1.5 mmol/L Mgcl2；0.5 mmol/LDTT；1 mmol/LNaF；1 mmol/L glycerol phosphate；1 prptease inhibitor cocktail tablet/50ml

BufferB：BufferA+0.15% of Nonidet P-40；

BufferC：20 mmol/L Hepes 7.5；420 mmol/L Nacl；1.5 mmol/L Mgcl2；0.5 mmol/LDTT；1 mmol/LNaF；1 mmol/L glycerol phosphate；1 prptease inhibitor cocktail tablet/50ml

DXY网友kevinfong回复：你是不是分离细胞浆蛋白和细胞核蛋白，然后做Western发现细胞核中也有Ikb-α，或者细胞浆中也能检测到Oct-1啊？如果是或者，我觉得挺正常的，因为转录因子部分也存在于细胞浆，至于Ikb-α是不是细胞质特异性的我就不清楚了。但是，我觉得你用的是试剂盒应该没有问题的，然而也很难彻底分开，在步骤4吸取上清时小心点，不要触及沉淀，可以剩少许上清（这部分上清不收集），然后用白尖再把这些上清吸干净扔掉，这样可以尽量减少各个组分的污染。我用过试剂盒分过细胞浆和细胞核蛋白，感觉还行，至少不影响实验结果。如果，你想精确的彻底的分离，或者想得到Oct-1的话，建议你采用蔗糖梯度离心方法再次富集你收集的各个组分上清，这可以分离得到比较纯的你想要检测的那些蛋白组分。

楼主问：感谢指点，我有如下几个问题，多谢回答

1、在实验过程中，我收集上清的时候的确是收集一部分，但是剩下的没有弃下，下次改进。

2、对于我的抗体。Ikb-α是多克隆抗体，非特异性很强，感觉十分难做；OCT-1虽然是单抗，但我基本上没有检测它应该的大小（90K左右），只是检测到其它的分子量，不清楚为什么，大概40多K 吧！

3、我想请问您用试剂盒的效果不影响实验是什么意思？那哪个牌子的试剂盒好用，还有，您检测的方法跟我的抗体一样吗？

4、我的配方里面一直是加好了DTT的，不现加现用有什么后果吗？

DXY网友kevinfong回复：首先我做的抗体跟你不一样，但我可以回答你的问题：

2.我用的大部分抗体多是多克隆抗体，也会有其他非特异性带，但是不论怎么目的带总是最明显的，基本上不会影响结果，而且我也发现不同的来源的细胞用同一种抗体，有的就不会用其他非特异性带，有的不管怎么都会有非特性带，有几个方法可以尽量消除非特性带，抗体的量少加一点，我抗体基本上都是1：1000以上，孵育过夜，二抗的量1：20000（北京中杉），再则可以减少上样量，我一般50-75ug左右，这些前提抗体必须效价高。

我在抗体上吃过很大的亏，买了两家公司的抗体，都是进口有名的，都没杂出来，后来用了第三家的，就很顺利的做出来了。所以抗体很重要。所以，你首先得排除抗体的问题。我没做过Ikb-α和OCT-1，所以不敢断定你用的OCT抗体有问题，不顾第一次做，一般抗体量加多一定，先保证抗体能杂出来，接下来再做改善。

3.我指的是我用的试剂盒分离细胞浆细胞核组分，那它们去做我的实验包括Western和EMSA都能检测目的蛋白。至于哪个试剂盒好用，就不好说了。我用的是国产碧云天的。

4.一般情况下DTT都是另外配好冻-20度，用时加。但我在配细胞裂解液时就把所有的成分包括DTT配好了，然后分装-20度保存。用时也没发现有什么不妥的。所有，我觉得应该没有什么大的影响。