原位微量BCA蛋白定量法
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简述：
传统标准的BCA蛋白定量分析方法常规均使用试管或者微孔板进行检测，通过对传统方法进行改进，可使用BioTek公司的Take3TM 超微量多体积检测板进行原位微量BCA法蛋白定量分析。待测蛋白样品和BCA工作缓冲液按照顺序直接加在Take3TM板的微量定量孔处、温浴，使用EpochTM 微孔板分光光度计进行检测。和传统标准BCA方法（BCA工作缓冲液和蛋白质样品体积比为20:1）相比，该方法的蛋白检测灵敏度有明显的提高。相比与Mini-BCA分析方法，原位分析方法更加精确。
介绍
BCA法是十分常用的蛋白质比色定量方法，很多试剂供应商都提供基于比色皿和微孔板的BCA蛋白定量试剂盒。BCA蛋白定量法相对于其它比色定量法具有操作简单、稳定、灵敏度高等优点。相对于蛋白质的固有的280nm吸收峰检测，BCA检测法提高了蛋白检测灵敏度和特异性，消除了核酸的干扰，核酸干扰在对细胞裂解物或其他生物样品进行蛋白定量时总是一个难以避免的干扰。在碱性条件下，蛋白将Cu2+ 还原为Cu+ ，Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物，如图1，其吸光值与蛋白浓度成正比。测定在562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
图1. BCA法蛋白质定量。Cu（BCA）2耦合物在592nm有一很强的吸收值，7700L/mol/cm。
近几年开发的一些精密的检测仪器，都可以使用短光程、微量体积的样品进行比色定量，例如NanoDrop（ThermoFisher Scientific）。这个仪器内置了蛋白质280nm直接定量法，这种方法可以有效的避免浪费样品且操作简单。在直接蛋白定量的基础上，这些仪器还发展了蛋白质比色定量法，例如BCA法。通过调整蛋白质和BCA工作缓冲液的相对体积比，由原来的20:1调整为1:1,这种微量定量方法转换校准曲线的工作范围，使之更适合于微孔板或短光程检测，这种方法叫Mini-BCA法。然而对于这些通过把样品加在检测基座上的仪器来讲，蛋白质和BCA工作缓冲液必须先在一个额外的试剂槽里进行混匀和温浴，然后才能滴加到检测基座上进行检测。这样会增加操作的复杂性，增加了样品的浪费。
这里我们介绍一下如何使用Take3 超微量多体积检测板进行原位微量BCA蛋白定量法。使用Take3 超微量多体积检测板进行Mini-BCA法检测操作步骤简单，整个流程和使用典型的96孔微孔板检测相似，直接把BCA工作缓冲液和样品滴加在Take3板的微孔处，不需要先在其它容器混匀进行颜色反应。这样做的好处是可以提高操作的便捷性，每次检测只需要2ul样品，非常节约样品。
实验材料和方法检测试剂盒（Sigma-Aldrich公司）、小牛血清（BSA）（Sigma-Aldrich公司）。我们使用两种实验方法来进行BCA检测。
第一种方法
按照NanoDrop技术手册推荐的“Mini-BCA”法。其简要流程是：BCA检测系统混合好的10ulBCA工作缓冲液和10ul的标准蛋白或待测的10μl样品（1:1）在试管中混匀，37℃温浴30分钟后进行检测。
第二种方法
使用Take3超微量多体积检测板进行原位检测。其简要流程是：直接按照顺序滴加2ul标准蛋白或样品，然后再滴加2ul BCA工作缓冲液到Take3板的检测孔上，标准蛋白和检测样品每个2份，室温（22℃）孵育25分钟后进行样品的定量检测。
如图图2. Take3 微量定量板上的16个检测孔的上下石英表面相当于原位BCA法反应和检测管路，加样完成后合上Take3板，室温放置25分钟后，使用Epoch微孔板分光光度计检测。
小牛血清标准蛋白按照1:3或1:2 系列稀释成7个点，浓度范围分别在0.01-2mg/ml或0.01-3mg/ml。1:2系列稀释的样品用于比较两种方法的灵敏度。为了比较两种方法的精确性，我们根据图3 制定了一个Take3板布局，使用6个点 1:3系列稀释的样品，浓度范围在0.01-1.0mg/ml。在Take3板上进行微量体积原位BCA分析，推荐使用下面的布局。
空白对照是1:1体积的BCA工作缓冲液和去离子水。BCA法蛋白定量的检测波长为562nm.BSA的实际浓度是使用Take3和1cm标准光程的BioCell石英比色杯在Epoch分光光度计上检测得到的。
结果&讨论：
反应动力学典型的BCA法检测方案需要体积比为20:1的BCA缓冲液和蛋白样品，NanoDrop 技术手册使用的是4ul蛋白质样品加到80ulBCA缓冲液中。即使在标准曲线的高浓度端（例如： 2mg/ml BSA），BCA工作缓冲液的活性成分的摩尔量明显超过参与反应的蛋白质（见表1）。同样也超过双缩脲反应的结合位点（肽键，半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，酪氨酸），但是这浓度的差异也是有一定限度的，因为蛋白质的三维结构会阻碍Cu2+和BCA的进入这些位点，形成大体积螯合物。因此减少蛋白质样品和BCA工作缓冲液的稀释比例应当保持反应的动力学并且保证标准曲线的工作范围能够覆盖到低蛋白浓度。
表1.蛋白标准品和BCA工作缓冲液体积比为20:1时，其中BSA标准品和BCA工作缓冲液的有效成分的浓度和摩尔量的比。
推荐的是1:1体积混合的BCA工作缓冲液和蛋白质样品，这里我们使用10ul蛋白质样品和10ulBCA工作液进行混合反应。大大减少蛋白质样品的稀释比例，并且也改变了BCA分析方法的动态范围，将检测浓度降低到0.01mg/ml.
我们修改了实验方案以适合原位微量BCA检测，2ul BSA标准品或样品，然后再滴加2ul BCA到Take3 微量板的检测孔上，合上检测板室温孵育，图4 显示了1mg/ml BSA 标准蛋白的反应进程。
图4. 562nm处检测原位微量BCA的反应进程，BSA的浓度为1.0mg/ml,孵育室温为22℃
目前大部分的BCA蛋白定量法在室温下需要2个小时进行颜色反应或提高温度（37℃或60℃）以缩短反应时间。这里我们使用了20分钟就达到满意的颜色反应。我们选择25min孵育时间使最大程度的颜色反应和4ul反应体系的最小程度蒸发达到一个平衡。
1:1反应体系灵敏度增强
图5 显示了使用反应体系为1:1的原位微量BCA法和反应体系为20:1传统的BCA法进行比较，原位微量BCA法的灵敏度要高于传统BCA方法。
图5. 使用Take3超微量多体积检测板检测分析比较原位法检测和先在离心管以20:1体积混匀再滴加到Take3板上进行检测。
原位微量BCA法灵敏度的增加和显着减少蛋白质在BCA工作缓冲液中的稀释有关，把动态检测范围延伸到更低的蛋白浓度，直至定量的极限10ug/ml BSA.和传统的20:1的反应体系相比，当蛋白浓度>=2000ug/ml时，检测的线性会受到一定的影响。这是因为稀释比例的降低将Cu2+的摩尔浓度相对于BSA浓度的过量被减少了100倍。鉴于这里有超过650个可能反应位点在BSA的一级结构中，蛋白质成为双缩脲反应的限制因素。当我们把标准曲线外推至3000ug/ml（数据没有显示）时，曲线则已经呈现平坦趋势。有鉴于此，我们推荐原位微量BCA法的标准曲线范围在10ug/mL-1000ug/mL.
提高了定量的准确性
板上有16个用于检测微孔，可以同时完成标准品和未知样品的原位定量检测，类似于微孔板中进行的实验。这样可以减少由于孵育时间和温度变化的原因带来的定量误差-已知可以影响BCA分析的变量。使用Take3板按照上图3进行排列样品，原位定量法和“Mini-BCA”法相比，原位定量的准确性有明显的提高。参见表表2. 使用原位BCA法和“Mini-BCA法”检测两个BSA样品，比较两种方法的精确性。负的%精确度表示BSA浓度被低估，相反，正的%精确度表示BSA浓度被高估了。用来计算每个样品做3次。
结论：
原位微量BCA法和Mini-BCA相对于传统的20:1反应体系的BCA法，都使蛋白检测浓度范围向下延伸一个数量级。从蛋白样品和BCA工作缓冲液的角度来看，相对于Mini-BCA法，原位微量BCA法更为简单、快捷、经济。此外，原位微量BCA法在同一微量板上同时进行标准蛋白和未知样品的检测，进一步提高了定量精确性。
