【专题讨论】多种WB条带问题，时好时坏，找不到原因，大家帮忙来！

以前做的很好看的条带现在怎么做也做不出来原来的效果了，所有的液体和buffer都换了，尝试了很多次，都没见改善，大家来帮忙看看问题出在哪里？

1，做的好的内参：不管齐不齐，但至少条带是一根一根的，边界很清楚，没有糊，没有影子，干净，即使中间空一个泳道，也不会出现串孔的现象。

2，做的好的目的蛋白：可能拍照的原因出现了很多格子，但是不影响，目的条带是两条带，同样每跟都很清晰，没有串孔，没有拖带，边缘没有发毛发糊。

以上两条是同一时期做出来的，那时基本怎么做怎么出来，都很漂亮。

可是下面的就有很多问题了，条带基本看不清楚，不能用。

3，问题一，目的条带非常不清晰，只有影子，边界不清楚，糊糊的，毛毛的，同样上样量的情况下，连成一条线，分不出一根一根的，抗体用新的试了也不见好，这是几个条带放在一起显影的图，没有一个清楚的。

4，问题二，条带虽然比3的显影效果好了一点。但是，仍有些问题，同样是内参，对比1，就显得很差了，条带模糊不清，边界发毛，这是主要问题，泳道不清，有串孔，同样上样量，会连成一线。

这个问题自从WB做的不好看以来，一直存在，出现概率跟高，换了新的样品，换了抗体，换了buffer，不见改善。

5，问题三，最近连着出现了两次，这两次胶都是现配的，等干好了就跑。

泳道里基本没有目的条带，但是大概在条带的KD位置，两个泳道之间的裂隙里出现了阳性杂交，像是两个孔的蛋白互相挤着了，把蛋白都挤到孔边缘了：

上下是同一块胶跑出来的，上面是一张膜，没有出现“挤”的现象，下面这张膜就“挤”的不行了，在两泳道之间出现目的斑。并且可以明显的看出来，中间空的一个孔里被两边的蛋白挤满了，本身应该是像1条带里空着的。

这张也是，泳道里没有，孔与孔之间里有蛋白的样子，最左边两孔是应该高表达的。

越是在关键的时候，条带越是出不来，着急的！

所有的buffer基本都换了，把自己的样品拿到别的实验室也跑了，结果人家的条带很清楚，我的还是糊糊的，感觉是从封闭开始，用的buffer不行，TBST重新配了，我们实验室用的是tris-base，用盐酸调PH值7.4-7.6之间，每次牛奶都是新配的，一抗二抗也新的，洗膜用的TBST都跟以前一样啊，哪里出了问题呢？