MHC I STREPTAMERS® 检测与分离抗原特异性 (CD8+ T) 细胞

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通过 TCR 与 MHC 多肽复合物间的特异性识别作用，可以对抗原特异性 T 细胞进行检测和分离。然而，当 MHC 多肽复合物为单体状态时，其与 T 细胞的结合并不稳定。若将其四聚体化后，其与 TCR 的结合可保持在一个稳定的状态，成为检测的工具。德国 IBA Lifesciences 研发的 MHC I STREPTAMERS^® 技术，利用了这一特点，将传统的链霉亲和素改进为 Strep -Tactin^®，搭配荧光标记或纳米磁珠，与多聚化的低亲和力MHC I-Streps 形成复合体，实现了对抗原特异性 (CD8⁺ T) 细胞的检测和分离 (如，流式分析) 。此技术的特点在于，荧光或磁性微珠等标记物可以通过使用 Biotin (生物素) 而去除，保留了细胞的真实特性，得到的功能性的，label-free 的细胞可用于下游的实验研究。

1) MHC I STREPTAMERS^® 技术解析

MHC I STREPTAMERS^® 由两部分组成：

· MHC I-Strep，即连接了 Twin-Strep-tag^® 和抗原肽的 MHC I 分子。

· 荧光 (PE/APC) 或磁性微珠标记的 Strep-Tactin^® multimer

图 1.1 通过磁珠标记的MHC I STREPTAMERS^®进行细胞分离

2) MHC I STREPTAMERS^® 核心优点

· 多价结合，提供了精准的标记和高染色强度

· 多种选择，可从 60 余种 MHC I Streptamers 与相应多肽进行选择

· 模块化产品，适用于 FACS 分析与磁性细胞分选

· 试剂可逆，保证了选后细胞的完整功能

3) 实验流程

细胞染色步骤：

1．调整细胞浓度为 1x107cells/ 100 μl，从中取 1 - 2x106 cells；

2． 用去离子水将 10xBuffer IS 稀释为 1x，准备 3 ml 稀释后的 Buffer IS；

3．取 1ul Strep-Jactin^®PE 或 Strep-Tactin^®APC，0.8μl MHC I-Strep，与 1x Buffer IS 混匀为 10ul 的终体积，冰上孵育 45 分钟；

4．将上一步孵育完的 Streptamers 复合物加入到细胞悬液中轻轻吹打混匀，冰上孵育 45 分钟；

5．加入 200ul 1x Buffer IS 洗涤细胞 2 次；

6．染色结束的细胞可上流式就行分析或者分选（死细胞可用 PI 或 7 -AAD 排除）。

注意：

①在实验之前所有试剂均应该放在冰上或 4℃ 提前预冷，实验过程中亦如此；

②如果以上试剂用量不合适于本次实验样本，可进行滴定。具体操作为：仍然调整细胞浓度为 1x10＇ cells/ 100 μl，倍比增加 Streptamers 复合物的用量与 1 - 2x106 细胞悬液进行孵育，如下：

2 倍 Streptamers 用量（1.6 μl MHC I-Strep ＋2 μl Strep-Tactin^® PE in 20 ul buffer IS）

3 倍 Streptamers 用量（2.4 μl MHC I-Strep ＋3 μl Strep-Jactin^® PE in 30 μl buffer IS）

4 倍 Streptamers 用量（3.2 μl MHC I-Strep ＋4 μl Strep-Jactin^® PE in 40 μl buffer IS）

Streptamers 的解离：

1.350 gx5 min 离心收集细胞；

2．同时，用 1xBuffer IS 稀释 D-Biotin 到 1 mM 的工作浓度，准备 1 ml，放置于冰上；

3．向离心后的细胞中加入 200μl D-Biotin 工作液，冰上孵育 10 分钟；

4．孵育结束离心收集细胞；

5 重复步骤 3 和 4 -遍：

 

 

热销产品列表

Research field	Allele	Antigen	Sequence	Cat. No.
Human
Cytomegalovirus (CMV)	HLA-undefined 0201	CMV pp65	NLVPMVATV	6 - 7001 - 001
	HLA-undefined 0702	CMV pp65	TPRVTGGGAM	6 - 7027 - 001
	HLA-undefined 2402	CMV pp65	QYDPVAALF	6 - 7028 - 001
	HLA-undefined 1101	CMV pp65	GPISGHVLK	6 - 7050 - 001
	HLA-undefined 0101	CMV pp50	VTEHDTLLY	6 - 7024 - 001
	HLA-undefined 0801	CMV IE- 1	QIKVRVDMV	6 - 7017 - 001
	HLA-undefined 0201	CMV IE- 1	VLEETSVML	6 - 7041 - 001
Tumor	HLA-undefined 0201	WT- 1 (Wilms tumor protein)	RMFPNAPYL	6 - 7019 - 001
	HLA-undefined 0201	HA- 1 H	VLHDDLLEA	6 - 7018 - 001
	HLA-undefined 0201	MART 1	VLQELNVTV	6 - 7007 - 001
	HLA-undefined 0201	NY-ESO- 1 (cancer-testis antigen)	SLLMWITQV	6 - 7013 - 001
Epstein-Barr virus (EBV)	HLA-undefined 0201	EBV BMLF- 1	GLCTLVAML	6 - 7002 - 001
Influenza	HLA-undefined 0201	Influenza A virus M1 protein	GILGFVFTL	6 - 7003 - 001
HIV	HLA-undefined 0201	HIV- 1 reverse transcriptase	ILKEPVHGV	6 - 7005 - 001
Mouse
Transgenic mouse OVA model	H- 2 Kb	Ovalbumin	SIINFEKL	6 - 7015 - 001

 

4) 实验数据

-高染色强度：使用可逆的MHC I STREPTAMERS®染色抗原特异性 (CD8 + T) 细胞

STREPTAMERS^® 的高染色强度，可以最佳化的检测到小型T细胞群体。对 CMV-specific CD8⁺ T 细胞使用 HLA-undefined 0201 CMV pp65495 - 503 Streptamer^® 进行体外染色 (右)，并与常规多聚体 (左) 进行染色效果对比。染色使用 CMV 阳性个体在 4℃ 下进行。

-染色试剂可逆：染色小鼠抗原特异性 (CD8 + T) 细胞后，再去掉染色。

使用H2 -Kd/LLO91 - 99 Streptamers®染色Listeria monocytogenes, epitope LLO91 - 99 CD8⁺ T 细胞。用与 LLO91 - 99 特异的 MHC I-Strep H2 -Kd 偶联 Strep-Tactin®PE 观察抗原特异性细胞。 加入 1 mM d-biotin，在不同的时间点监测单体 MHC 分子的后续解离。 加入 biotin后 20 分钟，染色试剂从细胞中大量去除。 染色和解离在 4℃ 进行。

-染色试剂可逆：染色人抗原特异性 (CD8 + T) 细胞后，再去掉染色。

与传统的多聚体相比，使用 HLA-A * 0201 / Her2 / neu369 - 377Streptamers®染色 Her2 / neu 特异性 CD8 ⁺ T 细胞在 1 mM d-生物素存在下短暂孵育后，显示出 Streptamer®染色剂与细胞的完全解离 (右)。 抗原特异性 T 细胞通过与与 Her2 / neu369 - 377 特异的 MHC I-Strep HLA-A * 0201 偶联的 PE 进行观察。 在 4℃ 下进行染色和解离。