这种阴选方法快速简单，10 分钟得到想要的活性细胞！

一起看 NK 细胞分选方案与数据～

在细胞分选中，阴选通常是指对非目的细胞进行标记和去除，来得到目的细胞。避免通过直接的标记目的细胞（比如使用表面特异性抗体标记），从而来减少细胞活化可能。因此，阴选方法的优势在于可以保持目的细胞未受刺激的原始状态，分选速度快。不过相对阳选而言纯度稍低，而且需要事先对原始样品的细胞组分有所了解，准备相应的标记抗体。

阴选的优势与劣势

本文将大家分享一种新的阴选方法和相关数据，利用 Strep-Tactin^®TACS 的琼脂糖层析柱，这种层析柱既可用于细胞阳选，也能用于细胞阴选中。

为了评估 Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖柱细胞阴选的效率，实验从外周血单个核细胞（PBMC）样品中富集了 CD3^- CD56⁺自然杀伤细胞（NK）。材料为Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖柱以及生物素化的抗体，仅 10 分钟，便完成了细胞阴选（图 1）。

流程如下：

阴选流程：生物素化抗体与 PBMC 孵育标记非目的细胞，加入至亲和层析柱后，即可收集目的细胞

实验方案

CD3^- CD56⁺ NK 的细胞阴选

· 将 1 x 10⁷ 的 PBMC 细胞用 100μl 的 Buffer 稀释（Buffer CI：含 0.5% BSA 的 PBS 缓冲液，1 mM EDTA）

· 加入多种生物素化抗体，室温下孵育 5 分钟。生物素化的抗体包含以下几种，每种抗体 0.5 μg：CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。

· 将孵育好的样品加入到 1 ml 的 Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖层析柱上（柱子最大结合能力：1 x 10⁸个细胞）。

· 当样品完全进入柱子后，加入 10 ml Buffer洗脱两次，就可以得到未结合的细胞了。后续使用流式细胞术检测富集的 NK 细胞。

（此处用到的试剂见文末）

结果与讨论

通过使用阴选将非目的细胞去除后，获得了高纯度的目的细胞群。实验用到了 Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖层析柱，并进行了两次独立实验。结果如图 2 所示。

NK 细胞从 6% 的起始丰度（图 2A）通过富集达到了 86%（图 2B）。所有抗体标记的细胞群几乎均去除，剩余的非 NK 细胞主要成分为未标记的细胞。数据表明， Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖柱不仅可以在阳选中使用，还可以搭配适当的抗体标记，有效进行细胞阴选。

图2：通过阴选富集 PBMC 中的 CD56 + NK 细胞。Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖柱与生物素化抗体结合，从而实现NK 细胞的富集，纯度从 6%（A）提高到 86%（B）（n = 2）

 

实验材料为什么使用 Strep-Tactin^®TACS？

实验中使用的 Strep-Tactin^®TACS 亲和层析柱，主要成分 Strep-Tactin^® 是链霉亲和素（Streptavidin）的一种突变体，借助链霉亲和素-生物素作用原理，Strep-Tactin^® 与生物素（biotin）的亲和力介于 100 pM – 100 fM 间。当向含有的 Strep-Tactin^® 层析柱中加入生物素化的抗体时，便能将其固定在柱子中，特异性捕获细胞，进行阴选。

 

抗体的选择

实验中可以选择的抗体有亲和力较高的生物素化单克隆抗体（图 3A），或带有 Twin-Strep-tag^® 的抗体，如图 3B 所示。

带 Twin-Strep-tag^® 的单克隆抗体在生产和纯化更便捷，还可以通过加入生物素来洗脱已经结合在柱子上的细胞。并且，Twin-Strep-tag^® 的单克隆抗体的位置相对更固定一些。

使用生物素化抗体好处在于其与 Strep-Tactin^® 的亲和力相比之下更高，可以稍提高阴选效率，但是总体来说两种类型的抗体对细胞阴选都是非常有效的。

图：单克隆抗体用生物素（A）或 Twin-Strep-tag^®（B）标记，两种都可以固定在 Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖层析柱中。

 

总而言之，作为灵活的细胞研究工具，Strep-Tactin^®TACS 琼脂糖层析柱在细胞分选的应用不仅限于阳选，还可以在阴选中结合多种生物素化抗体（或Twin-Strep-tag^®标记的抗体）一起使用。整个细胞分选过程只需 10 分钟，是一种快速有效的细胞阴选方案。

实验中用到的产品列表

Strep-Tactin® TACS Agarose Column, 1 ml（Cat.no 6 - 6310 - 001）

10x Buffer CI, 85 ml （Cat.no 6 - 6320 - 085）

Anti-hu CD235a Biotin mAb

Anti-hu CD14 Biotin mAb

Anti-hu CD3 Biotin mAb

Anti-hu CD4 Biotin mAb

Anti-hu CD15 Biotin mAb

Anti-hu CD123 Biotin mAb

Anti-hu CD19 Biotin mAb

Anti-hu CD279 PD- 1 Biotin mAb

Anti-hu CD36 Biotin mAb