免疫组化染色方法及常用抗原修复方法

一、SP 法

1）脱蜡、水化；
2）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；
3）3% H2O2（80% 甲醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；
4）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；5）抗原修复；
6）PBS 洗 2～3 次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗 50μl，室温静置 1 小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃ 过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；
11）滴加 Ⅱ 抗 40～50 μl，室温静置，或 37℃ 1 小时；
12）II抗中可加入 0.05% 的 tween-20。
13）PBS 洗 3 次各 5 分钟；
14）DAB 显色 5～10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗 10 分钟；
16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗 10～15 分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。

二、SABC法

1）脱蜡、水化。
2）PBS 洗两次各 5 分钟。
3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4）抗原修复。
5）PBS洗5分钟。
6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7）滴加 Ⅰ 抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8）PBS洗三次每次2分钟。
9）滴加生物素化二抗,20℃～37℃ 20 分钟。
10）PBC 洗 3 次每次 2 分钟。
11）滴加试剂SABC，20℃～37℃ 20 分钟。
12）PBS 洗 4 次每次 5 分钟。
13）DAB 显色：DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14）蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。
15）脱水、透明、封片、镜检。

三、常用抗原修复方法

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片：

1、抗原热修复

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如 TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以 0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其 pH 值在 6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的 pH 值偏差，请自行调整。

1）高压热修复

切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

2）煮沸热修复

切片脱蜡至水后，放入盛有 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时 15~20 分钟，然后端离电炉，室温冷却 20~30 分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗。

3）微波热修复

切片脱蜡至水后，3％ H2O2 处理 10 分钟，蒸馏水洗 2 分钟 × 3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃~98℃ 之间并持续 10~15 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却 10~20 分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。

PBS 洗，下接免疫组化染色步骤。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ 等。

2、酶消化方法

常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37℃，切片也预热至 37℃，消化时间约为 5~30 分钟（胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从 0.05% 至 0.25% ）； 胃蛋白酶消化37℃ 时间为 30 分钟。皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin 溶液，消化时间为室温孵育 30 分钟。 适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN 等。