手把手教你如何提取 RNA？

一、目的

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化 RNA。RNA 质量的高低经常影响 RT-PCR、cDNA 库构建和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。

二、主要试剂

Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

1. Trizol 试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。

2. RNase 污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分 RNA 会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源 RNase 降解了 RNA。

4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入 Trizol 试剂同时加入无 RNase 的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃ 避光保存一年。

三、预备工作

RNA酶（Rnase）是导致 RNA 降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase 完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备 RNA 时必须戴手套。

2.RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以 DEPC 配制的 70% 乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理

（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明 RNase-free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。

处理的步骤如下：

1.在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEPC 使其终浓度为 0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC 二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）

2.将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中 37℃ 或室温下处理过夜。

3.将 DEPC-H2O 小心倒入废液瓶中，将装有 DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少 30 分钟。

4.灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。

（2）玻璃和金属物品 250 ℃ 烘烤 3 小时以上。

DEPC（二乙基焦碳酸酯）

ODEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

ODEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。

1.试验所用试剂也可用 DEPC 处理，加入 DEPC 至 0.1% 浓度然后剧烈振荡 10 分钟再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则 DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性。

2.但DEPC能与胺和巯基反应因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。

四、实验步骤

1. 取 50~100mg 的组织加入1 ml Trizol 试剂，用匀浆器打匀（ Trizol 先放于冰上）。

2. 将匀浆室温放置 5 min。

3. 加入 200 μl 氯仿剧烈震荡混匀 30s，冰上静置 3 min。

4. 12000 rpm，4℃ 离心 15 min。

5. 将上清液小心转移到新的 1.5 ml离心管中（取 400 μl ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置 15 min。（此步中留意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿滥。）

6. 12000 rpm，4℃ 离心 15 min 。

7. 小心移去上清液，防止 RNA 沉淀丢失。

8. 用 70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入 700 μl乙醇，将 RNA 沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）

9. 8000 rpm，室温离心 10min。

10. 尽可能彻底地吸走上清，防止 RNA 沉淀丢失。

11. 真空离心干燥 3~5 分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12. 沉淀用30 μl DEPC-H₂O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理 10 min。

13. RNA检测

（1）测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0 。

（2）进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性和污染情况。

低得率：A.样品裂解或匀浆处理不彻底；B.最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。