手把手教你用 dyyTrizol 法提取 RNA
丁香园
1 准备
1. 电泳：RNA 专用 0.5×TBE 缓冲液、DEPC 水
2. 超净工作台：无 RNA 酶污染的枪头及 EP 管（1.5、0.2 ml）、镊子、1.5 ml EP 管架、离心管架、0.2 ml PCR 管架（200 μL 枪头盒代替）污物缸。一次性薄膜手套和橡胶手套、卫生纸、75% 乙醇、RNase Free 水、15 ml 离心管。
2 样品处理：RNA 提取前的步骤
☞ 悬浮细胞
每 1 ml Trizol 可裂解 5×106 动物、植物或酵母细胞，或 107 细胞。
☞ 贴壁细胞
1. 从培养箱取出细胞融合率达到 100% 的 T25 细胞培养瓶，弃去培养基。
2. 用弯头滴管将残余液体给吸去
3. 一个培养瓶 10 cm2 加入 1 mL Trizol，故加入 2.5 ml Trizol 裂解细胞， 用 1 ml 枪头反复的吹打培养皿底的细胞，或用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠，至少 2 分钟，直至细胞全部溶解在 Trizol 中，Trizol 变清亮透明为止。如果裂解不彻底， 增加 Trizol 的量，确保一定要将所有细胞全部裂解。
用注射器吹打力度会比移液器的大，效果更好（注射器的剪切力更大，而 RNA 分子比较小，对剪切力有好的忍受力）。
4. 用 1 ml 枪头吸入 15 ml 离心管，漩涡振荡 30 秒，离心，将上清转移至 3 个 1.5 mlEP 管中（2×1 ml+0.5 ml），放置于-80℃ 冰箱（室温下可以储存数小时，-60℃to-80℃ 下样品可储存至少一个月），或者马上进入下一步的 RNA 提取操作。
注意
1. Trizol 并不能马上穿透细胞并保护细胞内的 RNA。这时细胞内的 RNA 酶可以很轻易的降解尚在细胞内的 RNA。所以必须尽快的让细胞溶解。
2. 有些细胞比较难溶解，吹打的时间需要适当延长。
3. 最高转速离心的目的是为了去除一些没有溶解的细胞（特别是当细胞量太大，或者处理细菌时）。
4. 有效保存在 Trizol 中的 RNA 在常温中可以放置 24 小时而 RNA 不降解， 建议采用干冰运输。
5. 如果细胞量多（大于 5x106 细胞量），建议取 200 uL 作为该样本的备份。
3 RNA 提取简要步骤
离心机预冷→样品 1 ml，氯仿 200 μl（混匀静置 2～3 min）→离心 12000 g/15 min（可以此时去配胶）→等体积异丙醇（静置 10 min）→离心 12000 g/10 min→75% 乙醇 1 ml（挥发）（-20 ℃ 放一年，4 ℃ 放置 1 周）离心→RNase Free 水 30～50μl→Nano drop 测浓度→电泳→RNA -80 ℃ 储存。
4 RNA 提取的详细步骤
1. 离心机空转 15 min 预冷至 4 ℃。
2. 取出 RNA 专用的氯仿、异丙醇、75% 乙醇、RNA free 水、1.5 mlEP 管及两管样品（Trizol 刚刚处理好或者处理好后冻存于 -20 ℃ 的细胞）、离心管架、EP 管架，紫外灯照射 30 min。
3. 加入 200μl 氯仿剧烈振荡混匀 15 s，室温静置 2～3 min，分为 3 层，上层是水相、中层是变性蛋白、下层是有机层 （鲜红色下层，含有蛋白质、多糖、脂肪酸、细胞碎片和少量 DNA）。
注意
1. 1 mlTrizol 处理过的样品加入 200 μl 氯仿。
2. 氯仿很重，请先靠近被加样容器后再加样。
3. 禁用漩涡振荡器，否则基因组 DNA 易断裂。
4. 离心 12 000 g，15 min，4 ℃。（准备新的无 RNA 酶 EP 管）。
5. 离心之后有分层，上层含有 RNA，占总体积的 50%，倾斜 EP 管 45 度，吸出水相（注意不要吸到壁上的蛋白质和下层的红色液体）至新的 EP 管中，注意枪头不要贴近管壁，分多次吸取，第二及第三次吸的过程小心不要吸到有机相吸至离有机相 2～3 mm 处即可。若同时提取 DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于 4℃ 冰箱， 若只提 RNA，则弃下层酚相。
6. 加入 500μl 异丙醇，混匀，静置 10 min。
7. 离心 12 000 g，10 min，4 ℃，离心后底部有透明略白色的沉淀（太白是蛋白质）轻轻倒掉液体，底部液可轻轻吸出（或直接用枪吸去，小心不要吸到底部沉淀）。
8. 加入 1 ml 75% 乙醇沉淀 RNA，轻轻混匀（此时 -20 ℃ 下能存放一年，4 ℃ 下能存放一周），以洗去盐离子（此时沉淀不会全部溶解）7 500 g，5 min，4 ℃ 底部有沉淀，弃去液体，静置让乙醇挥发 （5～10 min）， 但不要让 RNA 彻底干燥，这样会导致它失去可溶性， 可用 200 μl 枪头吸去残余液体。
9. 加入 20～25 μl RNA Free 水/TE Buffer/0.5%SDS，RNA 沉淀立即溶解，或者 55～60 ℃ 水浴 5～15 min 。
注意
1. H2O、TE 或 0.5%SDS 均须用 DEPC 处理并高压。
2. 如果 RNA 样品是用于酶反应，不要用 0.5% SDS 溶解 RNA。
10. 准备 2 管 0.2 ml EP 管均分装 1.5μl 的溶有 RNA 的溶液，带上标记笔、笔记本、小枪及小枪头测浓度。
Nanodrop 测浓度
打开电源，开机→用 RNase 水洗两遍→打开程序，选单位 ng/μl →滴加 RNase 水 2.5μl→点击 blank→滴加样品 1μl→点击 measure（重测时需要用水洗后再测，不然曲线会重叠，不用再校正）。
11. 电泳的上样量为 100ng ，RNA 浓度过高可用 RNase Free 水 调整 RNA可以用普通的电泳缓冲液，但是必须要更换新的电泳缓冲液，190v/10～20 min 评价 RNA 的提取质量。
A260/A280=1.8-2.0，太大说明 RNA 有降解，太小说明有蛋白质污染；分成 2-3 条带，5S 18S 28S，其中两条的亮度为 1:2，上样孔若有条带则有基因组 DNA 污染。
12. RNA 的提取质量比较好时将 1.5 ml EP 管内的 RNA 储存于 -80 度。
注意
1. 记得及时将浓度结果文件拷到优盘，或者拍照。
2. 样品吸出后，离心管里所剩样品不多时，直接将枪头打至离心管底部，不用再打至废液缸中。
3. 离心机离心管，开盖侧朝下，要配平。
4. 吸水相时，不要倾斜太多，会吸到有机相，吸到就弃去不用或者再次离心。
5. 氯仿室温放置就好，会挥发使整个冰箱都有气味。
6. DEPC 剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
7. 如果用于 RT-PCR 实验，即使有少量的基因组 DNA 也会影响实验结果，因此，实验前应使用 Recombinant DNase I 进行处理。
8. 选择一个不会被空调风或者其他外界气流影响到的位置来操作 RNA 提取步骤。
DEPC 水用于配制电泳缓冲液和溶解 RNA（晚上操作比较好）。
1. 准备：2L 平底试剂瓶，2L 量筒， 磁力搅拌子（合适的，不要太大也不要太小，太大转不动，太小旋转的力度小，行成的漩涡小），DEPC，去离子水，黑色塑料袋/锡箔纸。
2. 加 2 mlDEPC 于装有 2L 双蒸水的遮光试剂瓶中（里面有磁力悬浮子，瓶子用袋子或者锡箔纸遮光），磁力搅拌器搅拌 12 h 以上（正好过夜）。
3. 第二天早上去掉黑色袋子，拧松盖子，贴上高压灭菌指示带固定瓶口，高压蒸汽灭菌 20 min，使残余 DEPC 失活。
4. 将提篮从高压锅中取出静置冷却（大约一个上午），太烫拿出来会有大气泡（CO2）冒出，拧紧瓶盖室温放置。
文章来源：Yolander
题图来源：丁香通
