Nature 重磅！中山大学郑灿镔等人的研究成果为异种移植提供新思路
丁香学术
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背景介绍
全国每年约有 100 万器官衰竭患者，其中 30 万人急需器官移植，但能获得移植机会的仅约 2 万人，存在较大缺口。
为了解决移植器官组织来源严重不足的难题，领域内科学家寄希望于异种嵌合体技术。
多能干细胞 (PSCs) 是研究哺乳动物发育的重要工具之一，其在再生医学中具有巨大的潜力。
近年来，PSCs 衍生的跨物种嵌合体提供了一种在体内生成复杂组织的方法，这将有可能协助解决全球范围内供体器官移植短缺的问题。
但这一技术受到不同物种间进化差异和发育障碍的壁垒限制，导致人诱导多能干细胞在其他物种胚胎内嵌合难度大，总体嵌合比例较低。
为了解决这一难题，2021 年 1 月 28 日，来自得克萨斯大学西南医学中心的吴军团队（中山大学郑灿镔为第一作者，第一单位为中山大学）在国际顶尖期刊 Nature 在线发表题为 Cell Competition Constitutes a Barrier for Interspecies Chimerism 的文章，该研究首次揭示 细胞竞争是阻碍跨物种嵌合体形成的壁垒之一。
研究发现不同物种间干细胞在特定阶段普遍存在细胞竞争现象，为深入理解异种嵌合体发育壁垒机制提供新的思路，也为未来利用异种嵌合体技术解决临床上器官组织供体不足提供新的理论基础。
图片来源：Nature
主要内容
人类和小鼠始发态（Primed）干细胞之间的细胞竞争
首先，为了检测物种间细胞在早期发育中的竞争，研究人员建立了基于不同物种的多能干细胞共培养的体外模型。
结果发现，单独培养人胚胎干细胞 (H9-hESCs) 或单独培养小鼠上皮细胞干细胞 (mEpiSCs) 时，细胞增殖良好，并在长期传代中保持稳定的集落形态、多能性基因表达和基因组稳定性。
但是，在共培养过程中，许多 H9-hESCs 在接触 mEpiSCs 后发生凋亡。
从共培养的第 3 天开始，H9-hESCs 的数量显著低于单独培养，而 mEpiSCs 的数量保持相当，在第 5 天时，H9-hESCs 在共培养体系中几乎消失。
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上述结果表明，与单独培养相比，共培养的 H9-hESCs 中发生凋亡的细胞比例显著增加，而 mEpiSCs 未发生凋亡。
这种现象在使用其他两种人类 PSC 系时也得到了类似的结果。
处于原始态（Naïve）的干细胞和分化后（differentiated）的细胞是否同样存在这种现象？
接下来的实验表明，在人鼠原始态（Naïve）干细胞和分化后细胞共培养期间没有观察到明显的细胞竞争。
这些结果表明人 - 鼠 PSC 竞争局限于始发态干细胞，这与之前的小鼠研究一致，也就是将始发态的人诱导多能干细胞（iPSCs）注入小鼠胚胎时，小鼠早期胚胎可以利用细胞竞争机制「杀死」外来的人类干细胞。
至此，导致人鼠嵌合胚胎的嵌合率低下的原因被揭开一角。
图片来源：Nature
人 - 鼠细胞竞争的内在分子机制
人 - 鼠种间细胞竞争是接触依赖性的。
在非接触共培养 (如 Transwall) 中，并没有观察到明显的细胞竞争的现象，也无明显的人细胞凋亡现象。
这些结果表明，人类和小鼠启动细胞间的竞争可能不通过分泌因子，而是通过直接接触实现的。
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上述结果表明，细胞凋亡是细胞竞争中消除「弱势」细胞的主要机制，那么阻断细胞凋亡是否能克服细胞竞争这种现象呢？
为此，研究人员构建了稳定表达 BCL-2 的细胞系 BCL-2OE-hiPSCs。
结果发现，在与 mEpiSCs 共培养过程中，BCL-2 过表达可以有效防止人源细胞的消除；同样的，敲低或敲除促凋亡基因 Tp53 亦能完全挽救共培养体系中人类细胞的死亡。
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为了探究内在分子机制，研究人员分离出共培养或单独培养的人 H9 细胞，并进行转录组测序。
通过差异分析发现，与单独培养的 H9-ESCs 相比，共培养的细胞在第 1、2 和 3 天分别有 571，749 和 667 个上调基因。
分析发现在共培养第一天，NF-kB 信号通路基因显著上调，表明它可能处于激活状态。
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为了确定 NF-kB 信号是否激活人类细胞的凋亡，他们敲除了 HFF-hiPSCs 中的 P65 结果发现，P65KO-hiPSCs 不仅保持基因组稳定性和完整的多能性，而且共培养的 mEpiSCs 和 P65KO-hiPSCs 之间几乎没有竞争性相互作用。
由于 MyD88 是除 TLR3 外的所有哺乳动物 Toll 样受体的关键信号分子，其主要作用是激活 NF-kB 信号通路。
研究人员构建了 MYD88 纯合敲除的 HFF-hiPSCs (MYD88KO-hiPSCs)。同样的，与 P65 类似，MYD88 敲除挽救了 HFF-hiPSCs，使其免于被 mEpiSCs 攻击。
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克服种间细胞竞争增强了小鼠早期胚胎中人源干细胞的存活和嵌合
为了确定克服种间诱导的细胞竞争是否能能提高早期小鼠胚胎中人类细胞的生存，研究人员利用 EGFP 标记的 BCL-2OE-hiPSCs， TP53KO-hiPSCs， P65KO-hiPSCs，MYD88KO-hiPSCs 和 WT-hiPSCs 植入小鼠胚泡，然后进行体外培养。
结果表明，在培养 3、5 天后，只在少量注射 WT-hiPSCs 的胚胎中检测到 EGFP 信号，而大多数注射 BCL-2OE-hiPSCs， TP53KO-hiPSCs， P65KO-hiPSCs，MYD88KO-hiPSCs 的胚胎中仍含有 EGFP + 细胞。
这一结果也在免疫荧光分析和 Sanger 测序中得到了验证。
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细胞竞争普遍存在自然界多个物种
为了确定自然界中其他物种干细胞间是否同样存在这种细胞竞争现象，研究人员选择了小鼠、大鼠、猕猴、人和牛的始发态（Primed）干细胞进行研究。
结果发现，灵长类 - 啮齿动物、灵长类 - 牛和啮齿动物 - 牛中也观察到明显的细胞竞争现象，但是大鼠 - 小鼠和人类 - 恒河猴共培养则不同会导致细胞竞争的发生。
这一结果表明，不同物种之间存在不同水平的竞争力状态，这种竞争力状态的不同会导致细胞竞争的发生，而且这种竞争力状态似乎跟物种间进化距离密切相关。
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研究总结
综上所述，该研究首次发现不同物种始发态（Primed）干细胞之间的细胞竞争模式，在机制上将人类细胞死亡与启动多能性期间的种间细胞竞争联系起来，而且这种细胞竞争状态似乎跟物种间进化距离密切相关。
机制层面，研究发现这种细胞竞争是接触依赖的，并可由 NF-kB 信号通路的激活引发细胞凋亡。而 MyD88/NF-kB 或 P53 通路的失活则会增强早期小鼠胚胎中人类细胞的存活和嵌合性。
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据悉，该文章的共同第一作者为来自中山大学附属第一医院的郑灿镔博士、深圳华大生命科学研究院的胡莹莹博士和美国得克萨斯大学西南医学中心的 Masahiro Sakurai 博士。
延伸阅读
文章通讯作者为吴军博士，一直从事和关注多能干细胞的基础和应用研究，已经发表多篇具有影响力的文章，并且在国际上第一次证明了能将人诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPSCs）注入猪植入前胚胎，培育出不同程度的人猪嵌合体胚胎，是干细胞研究领域的一个里程碑。
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吴博士提到：「尽管近些年在产生啮齿动物种间嵌合体方面取得了很多突破性的进展，但在进化距离更远的物种之间仍未实现稳固的嵌合。在种间嵌合体形成过程中，供体的细胞可能被视为异常的细胞而通过细胞竞争被消除。克服种间干细胞竞争可以提高供体多能干细胞在异种嵌合体里的嵌合率。」
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参考资料：
1. Zheng, C., Hu, Y., Sakurai, M. et al. Cell Competition Constitutes a Barrier for Interspecies Chimerism. Nature (2021).
2. Wu, J., et al., Interspecies Chimerism with Mammalian Pluripotent Stem Cells. Cell, 2017. 168(3): p. 473-486 e15.
3. Amoyel, M. & Bach, E. A. Cell competition: how to eliminate your neighbours. Development 141, 988–1000 (2014).
4. Wu, J. & Izpisua Belmonte, J. C. Dynamic Pluripotent Stem Cell States and Their Applications. Cell Stem Cell 17, 509–525 (2015).
5. Yamaguchi, T. et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature 542, 191–196 (2017).
封面来源：站酷海洛 Plus
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