领域奠基之作：Cell 重磅报道可胞外展示的糖基化修饰 RNA——glycoRNA
丁香学术
261
多糖可以修饰脂质和蛋白质，调节所有生命领域的分子间和分子内的相互作用。因此，许多基本过程，如胚胎形成，宿主病原体识别和肿瘤免疫相互作用都是依赖于糖基化的。而通常人们认为，RNA 不是糖基化的主要目标。
RNA 作为另一种生物高聚物，是已知生命的中心。虽然 RNA 通常局限于 4 个碱基，但是转录后修饰（post-transcriptional modifications，PTMs）可以显著扩大 RNA 的多样性。目前已鉴定有超过 100 种 PTMs，但是除了少数基于单糖的 tRNA 修饰，迄今为止没有任何证据表明 RNA 和多糖存在着直接的联系。
然而，据最新研究报道事实可能并非如此。
2021 年 5 月 17 日，斯坦福大学 Ryan A. Flynn 和 Carolyn R. Bertozzi 团队合作在 Cell 上发表题为 Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells 的研究论文。
图片来源：Cell
研究人员通过一系列生物化学方法，发现保守的非编码 RNA 含有唾液酸化多糖，并且存在于多种细胞类型和哺乳动物物种体内。活细胞分析表明，大多数多糖修饰的 RNA 存在于细胞表面。
本研究通过对哺乳动物多糖修饰 RNA 的鉴定，揭示了 RNA 生物学和糖生物学之间存在直接的接口，并且 RNA 在细胞外生物学中的作用也得到了扩展，为转录后修饰调控 RNA 定位和功能提供了新的方向。
图片来源：Cell
研究内容
利用多糖代谢标志物标记细胞内 RNA
研究人员此前开发了基于代谢物标记和生物正交化学的方法，利用叠氮化物基团的前体糖来标记细胞或动物，从而发现蛋白质相关多糖。在利用其标记唾液酸前体（Ac4ManNAz）时，发现标记细胞中高度纯化的 RNA 中存在叠氮化物反应，提示潜在的多糖化 RNA 存在。
为了探究唾液酸化多糖修饰的 RNA（glycoRNA）是否存在，研究人员利用 Ac4ManNAz 标记 HeLa 细胞，然后提纯高纯度的 RNA，随后通过变性凝胶电泳分离和印迹分析，发现标记信号是时间依赖的，并且 DNase 处理并不影响 glycoRNA 信号，而 RNase 处理的影响可被抑制剂 SUPERaseln 阻断，表明 Ac4ManNAz 处理标记了细胞中 RNA。
随后研究人员在其他细胞类型中进一步证实了这种现象。
为了进一步评估是否可以在体内进行标记，研究人员对小鼠进行不同时间的腹腔注射，结果发现与细胞培养中一致的 glycoRNA，表明 glycoRNA 不仅是组织培养的人工产物，而且是广泛存在于多种细胞和组织类型的。
图片来源：Cell
glycoRNAs 是一类非编码 RNAs
由于变性凝胶电泳发现 glycoRNA 的迁移非常缓慢，因此研究人员推测 glycoRNA 可能是聚腺苷化（poly-A）的大 RNA。然而研究人员始终无法通过 poly-A 富集纯化 glycoRNA。于是研究人员利用长度依赖的 RNA 沉淀和结合硅胶柱，从小到大进行分离。有趣的是，glycoRNA 只与总 RNA 中一部分小 RNA 分离。
研究人员用蔗糖梯度和 SYBR Gold 染色分析标记的 RNA 分布，结果发现分离的是小 RNA/tRNA，18S rRNA 和 28S rRNA。
为了鉴定 glycoRNA 的转录本，研究人员利用蔗糖梯度从标记的 H9 和 HeLa 细胞中分离出小 RNA 片段。研究人员发现尽管细胞类型不同，但是 HeLa 和 H9 细胞 glycoRNA 的富集呈高度正相关，因此富集定义了 193 个 RNA 转录本为潜在的 glycoRNA。
研究人员发现在被修饰的 RNA 中有许多已知的和发挥关键作用的 RNA，其中 Y RNA 家族最为显著。因此，研究人员通过 CRISPR/Cas9 敲除来验证 Y5 为 glycoRNA。与野生型细胞相比，Y5 KO 细胞的标记信号量显著下降，与测序数据 glycoRNA 信号减少一致，表明 Y5 是富集最多的。
图片来源：Cell
在 glycoRNA 中检测标记和无标记的唾液酸
Ac4ManNAz 代谢主要是转化为唾液酸，然后变为 CMP - 唾液酸添加在多糖的末端。为了排除 Ac4ManNAz 转入其他代谢途径的可能性，研究人员使用 9Az - 唾液酸（可直接转化为 CMP - 唾液酸）作为代谢标记。
与先前的结果一样，9Az - 唾液酸产生同样的缓慢迁移的 RNA。使用霍乱弧菌的唾液酸酶（VC-Sia）处理标记的 RNA 会导致信号完全消失，而加热失活 VC-Sia 则不能。
研究人员为了探究唾液酸合成酶的作用，通过使用抑制剂 P-3FAX-Neu5Ac 处理，导致 glycoRNA 信号剂量依赖性减少，并在印迹中向更高的表观分子量转移，表明 glycoRNA 流动性降低是由于唾液酸减少。
为了确定 glycoRNA 是唾液酸化的，研究人员使用高效液相色谱荧光定量检测荧光探针 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene (DMB，衍生化游离唾液酸)，在细胞的总 RNA 中进行标记，发现了动物中常见的两种唾液酸形式 Neu5Ac 和 Neu5Gc。而当样品被 VC-Sia 或 RNase 处理时，则检测不到，进一步证实 glycoRNA 被唾液酸修饰的。
图片来源：Cell
经典的 N - 多糖合成机制有助于 glycoRNA 的产生
蛋白质上有两类主要的多糖，N - 多糖和 O - 多糖，两者都可以被唾液酸化。
研究人员使用遗传学、药理学和酶学的结合方法进行检测，探索 glycoRNA 结构是否与糖蛋白相关多糖结构相关。
IdID CHO 细胞系不能产生 UDP-Gal 和 UDP-GalNAc，所以抑制 N - 多糖和 O - 多糖。研究人员发现 Ac4ManNAz 处理 IdID CHO 细胞中基本没有 glycoRNA 标记。添加半乳糖而非 GalNAc 恢复了标记，同时添加进一步提高标记强度。这些结果表明 glycoRNA 多糖在结构上与蛋白质上发现多糖相关。
进一步测试了糖基化抑制剂对 glycoRNA 合成的影响，发现抑制剂处理导致标记的 glycoRNA 出现剂量依赖性损失。研究人员使用了糖苷酶进行处理，发现 N - 多糖消化酶处理会导致标记的部分丢失，而 O - 糖苷酶没有影响，参与标记的可能是 N - 多糖类型。
图片来源：Cell
细胞表面展示的 glycoRNA
唾液酸化多糖的生物发生在许多亚细胞室包括细胞质，细胞核和分泌途径。为了确定 glycoRNA 在细胞内分布位置，研究人员采用了两种生化方法。发现标记的 HeLa 细胞的核 RNA 不能检测到标记，而膜部分只包含 glycoRNA，表明 glycoRNA 与细胞膜细胞器密切相关。因为膜细胞器有精准的拓扑结构，进一步评估发现绝大多数 glycoRNA 可以进入膜性细胞器的腔隙内或位于膜表面。
鉴于糖聚合物的典型运输和定位，研究人员假设 RNA 糖基化可能使其运输到质膜，并出现在活细胞的细胞外表面。研究人员首先利用 VC-Sia 的特异的活性来切割唾液酸，在活的 HeLa 细胞中加入 VC-Sia 后，20 分钟发现标记信号发生变化，glycoRNA 水平降低。随后在贴壁细胞和悬液细胞中重复实验，结果显示 VC-Sia 都可以显著降低 glycoRNA 水平，表明在较短时间和完整的质膜环境中，VC-Sia 可以接近超过 50% 的 glycoRNA。
为了验证 glycoRNA 定位于活细胞表面，研究人员结合过氧化物酶催化近距离标记技术，利用凝集素作为细胞表面亲和力工具结合活细胞，然后招募过氧化物酶并将生物素 - 苯胺沉积在 glycoRNA 上。检测 RNA 发现 MAAⅡ（唾液酸）或 WGA（N - 多糖）染色时产生高分子量条带，而 ConA（甘露糖）染色没有。并且信号是 RNase 敏感的，在用唾液酸酯酶处理 RNA 时，生物素信号进入凝胶孔出现定量的变化，但信号量没有减少，表明多糖特别是唾液酸有助于 glycoRNA 的异常迁移。在细胞裂解液上重复，MAAⅡ 和 WGA 仍标记 glycoRNA，但三种凝集素 rRNA 条带都很弱。因此，在活细胞实验中的结果再次表明，大多数细胞 glycoRNA 位于细胞表面。
图片来源：Cell
Siglec 受体和抗 RNA 抗体可以识别细胞表面的 glycoRNA
由于 glycoRNA 位于细胞表面，研究人员想进一步评估现有的研究细胞表面生物学的试剂（抗体或重组蛋白亲和剂）是否与 glycoRNA 相互作用。J2 抗双链 RNA 抗体对 RNA 的 ds 区有特异性，通常用来识别感染 RNA 的细胞。在证实 J2 可以结合 Y5 等 glycoRNA 的 RNA 成分后，研究人员建立了流式细胞术检测细胞表面 RNA。结果发现约 20% 的 HeLa 细胞在 J2 染色中是阳性，用 RNase A 预处理导致结合被清除，而添加 RNase A 蛋白抑制剂则恢复。进一步检测使用糖基化抑制剂处理细胞后，观察 J2 与细胞表面结合的量依赖性损失，这也之前结果一致，表明被 J2 抗体识别的细胞表面 RNA 依赖于 N - 糖基化进行细胞表面定位。
为了进一步确定 glycoRNA 是否与多糖结合受体相互作用，研究人员探究了 sialic acid binding-immunoglobulin lectin-type（Siglec）受体家族是否能结合细胞表面 glycoRNA，使用可溶性 Siglec-FC 试剂，通过流式细胞术检测其与细胞结合。发现 12 种试剂中 9 种可以与 HeLa 细胞结合，其中 Siglec-11 与 Siglec-14 的结合对 RNase A 处理敏感，这些数据支持了细胞表面 glycoRNA 是 Siglec 受体的直接配体。
图片来源：Cell
研究结论
本研究发现由典型内质网 / 高尔基体生物合成机制产生的唾液酸化 N - 多糖，会修饰特定的哺乳动物 RNA，并且 发现 glycoRNA 存在于细胞表面。
这些发现表明了在多种细胞类型和哺乳动物中存在 RNA 被多糖修饰的现象，指出了一个新的 RNA 糖生物学研究方向，为 glycoRNA 的功能和化学结构的进一步研究奠定了基础。
参考文献
