怎么样的临床试验才能登顶 Lancet？

近日浏览 Lancet 网页，其主页放了一篇关于儿童克罗恩病（Crohn's Disease，CD）的队列研究，笔者并非消化内科相关，而是呼吸内科一年级研究生，抱着建模方式或许可以借鉴到老师的临床研究项目中的心态入了坑。

图一，3 月 15 日 Lancet 的主页截图

本文针对儿童克罗恩病并发症预测的多中心的队列研究，来自于 RISK Study。现在大多数 SCI 杂志对于临床研究接稿都要求试验开展前已进行临床试验注册，收完病人再去补是无济于事的。

图二，临床试验注册网页截图 ClinicalTrials.gov identifier NCT00790543

克罗恩病并发症分型：

狭窄型（structuring，B2）和穿透型（penetrating，B3），细胞外基质（extracellular matrix proteins，ECM）形成和降解间的平衡与两类并发症的联系。其异质性由宿主因素主导的，受环境和肠道微生物菌群的影响。

主要检测了四个方面的特异性的指标：基因型、微生物血清学、回肠基因表达、肠道微生物。

结果：建立了竞争风险模型预测并发症发生；有穿透型并发症风险的病人更应早期进行抗 TNFα 治疗；肠道菌群方面，Ruminococcus 与狭窄型密切相关，而 Veillonella 与穿透型相关；在狭窄型病人中，回肠 ECM 生成的基因表达上调，加入模型预测特异性大大增加。

接下来以 Result 解读为线索，解读大数据处理，分为 3 个部分。

第一部分解读：疾病并发症竞争风险模型和早期抗 TNFα 治疗的疗效比较分析

图三，随访时发展为狭窄或穿透并发症的生存曲线，图（A）为整个队列，图（B）为倾向匹配队列。

随访时间为 3 年，纵坐标为无并发症的百分比，横坐标是随访天数。早期抗 TNFα 的治疗减少发展为 B3 的 3 倍风险，而对发展为 B2 无明显影响，B3 风险高的病人更应该进行早期抗 TNFα 治疗。

纳入早期抗 TNFα 的治疗队列选用符合方案集（Per-protocol，PP）规则，只分析实际完成整个治疗的。配对运用倾向评分匹配法（propensity-matched analysis，PSM），依托倾向评分法（propensity score analysis，PSA），消除观察性研究的混杂因素，最终得到 1 个综合变量： 倾向性得分。再使用贪心匹配算法（greedy-matching algorithm），钳值（caliper）为 0.1 SDs。

表 1，疾病并发症的竞争风险模型和早期抗 TNFα 治疗的疗效比较分析

作者意图建立风险分层模型来预测并发症发生的风险，以及加入早期抗 TNFα 的治疗变量后对模型的影响。主要以 P 值决定是否将变量纳入模型。风险比（hazard ratio，HR）可从图中读出。

相比于标准 Cox 比例风险回归模型（standard Cox proportional hazard regression）关注的是临床的某一结局（单终点），竞争风险模型（competing-risk model）可分析多潜在结局的生存数据。评价早期抗 TNFα 的治疗，使用疗效比较研究（comparative effectiveness research，CER）。

第二部分解读：基因表达与并发症及其预测

基因表达通过第二代测序 RNASeq，运用到基因本体（Gene Ontology，GO）数据库，ToppFun 工具找到有表达差异的通路，DAVID 生物信息数据库来做功能注释富集分析（functional annotation enrichment analyses）。

图四（A），展示的是进展为并发症的病人回肠表达上调的基因的比例，横坐标是 B2（蓝条）-B3（红条）；纵坐标为富集明显的表达上调的 19 个基因本体通路，括号里是每条通路包含的基因数。

往上走是肠道细菌诱发急性炎症反应表达的基因，偏向 ECM 降解，对应穿透型（B3>B2）；向下是 ECM 累积的通路，偏向形成 ECM，对应狭窄型（B2>B3），照应前文提到的细胞外基质降解和产生的平衡。将 B2 vs B1、B3 vs B1 的结果结合在一张图上，生动的看到了两者的区别。

图四（B）是发展为并发症的病人的回肠基因表达组合的散点密度图，横坐标是 B2 vs B1，纵坐标是 B2 vs B3。基因差异表达倍数值（fold changes，FC），取 log2 是要缩小两者差距。可以看出 ECM 基因在 B2 中表达增高。

图四（C）展示的是火山图，X 轴代表基因差异表达倍数（FC，log2），Y 轴代表统计检验的显着性（p 值，-log10）。比较 B2 low probability（并发症预测低风险，实际却狭窄）和 B1 protected（并发症预测高风险，实际却没发展为并发症）。B1 protected 中，线粒体呼吸链（mitochondrial respiratory）基因（暗红色点）几乎全部表达上调；B2 low probability 中，ECM 重塑基因（亮蓝色点）表达上调。

以上是回肠基因表达的分析，那么如何将这个变量加入到竞争风险模型呢？

表 2，包含 ECM 基因标志的竞争风险模型

文章将图四（A）中 B2 最低端的 ECM 结构成分（位于 pathway 富集分析的分子功能部分）的 70 个基因中的 PC1（first principal component）作为基因标志，纳入到模型中，运用了主成分分析（Principal component analysis，PCA）。用 AUROC、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值评估 ECM 基因标志纳入对模型的判别能力的影响，发现其在预测 B2 时起到了关键的作用。

表 3，appendix 中的 Table S4 上调的回肠基因的通路富集分析，B2（这张图可以复习之前讲过的很多知识点）

第三部分解读：风险预测模型的有效性验证（Risk Prediction Validation）

建模相当于发挥分类器的作用，交叉验证（Cross Validation，CV）是常用的模型验证方法，可以从有限的数据中获得尽可能多的有效信息，流程：选取模型参数→导入训练数据（training set）→建模→用验证数据（validation set）测试模型效果。估计队列的样本量时，使用了模拟数据做从而确定样本量。当样本量支持将数据分为两份，用有效性验证（split sample）；样本量小，选用留一法（leave-one-out，LOOCV）验证。

文章中使用的 STROBE（Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology），是由国际医学期刊编辑委员会 2004 年制定的写作规范，投稿时应注意按规范书写。

小结

至此，通过三部分的解读，探讨怎么样的临床试验才能登顶 Lancet，如果这是一个作者写的，我一定会说不会计算机的生物学家不是好医生。

医生作为主体参与临床试验是必不可少的，作者一栏中大多是多中心的 MD，所以笔者特意查了下里面的 PhD，基本是生物信息、流病、基因组学分析的专业人士，可见一篇 Lancet 文章的发表是多学科的协作创新。

总之，走过基因组时代，我们又迫不及待地踏入了大数据时代，深度学习、神经网络、AI 这些原本活在计算机的语言同样冲击着生物医学界，如何结合传统生物学、基础医学对疾病机制进行深刻的认识，发掘诊断、治疗的新靶点、新方法，生物信息学或许是新的路数。

本文接近于零基础探讨，希望给同样的小白选手以思路，共同学习，纯属抛砖引玉，也望各路大神多多指点，分享经验。鉴于公众号阅读的简洁性，详细版发在丁香园论坛上，欢迎有兴趣的同道前来指导。

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