3 分线外挣扎的你，看别人如何登顶 Nature、Science

Nature，Science 是公认的世界四大名刊之二，也是进行科学研究者梦寐以求的宝地。那么，怎样的研究才可以入编辑的法眼呢？同时登上两大期刊是否就功德圆满了呢？今天的这个研究系列或许可以回答这两个问题，让我们一探究竟。

主角登场

2012 年 Nature：

Reduced Airway Surface pH Impairs Bacterial Killing in the Porcine Cystic Fibrosis Lung.

降低囊性纤维化猪气道表面 pH，将损害其对细菌的杀伤能力。

2016 年 Science:

Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.

气道酸化启动了 CF 小鼠宿主防御的异常。

疾病介绍

囊性纤维化（cysticfibrosis，CF），一种影响外分泌腺的遗传病，源于跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR) 的基因发生突变，CFTR 是负责 HCO3- 转运的离子通道。

上篇：2012 Nature

正片由楔子和四幕构成，前情交代 CF 模型猪和杀菌能力检测手段后，进入正戏。

最终证明，CFTR 使 HCO3-转运减少，ASL pH 下降，而影响气道 ASL 中的抗菌物质的杀菌能力。

楔子 隆重推出 CFTR 缺陷基因猪和抗菌检测金属网格

突破 1

建立了 CFTR 基因缺陷的 CF 模式猪

突破 2

金网格活体杀菌能力测量

单个细菌依次固定在金网格薄片上 (Fig. 1a,b)，放入气道，以此测定气道杀菌能力。通过生物素-链霉亲和素（biotin/streptavidin）将 S. aureus 固定到金网格（gold grids）放入气道表面，然后到荧光死菌/活菌染色 (SYTO 9/propidium iodide) 进行采相和计数。

第一幕 证明 ASL 在气道抗菌中的作用

一、动物实验

实验 1（体内）

操作：气管切口，将金网格放置于气道表面。

结果：30s，同窝 CF 猪只能杀伤 non-CF 猪 50% 的菌 (Fig. 1d)。

实验 2（体外）

操作：用乙酰甲胆碱刺激气道粘膜下腺体分泌杀菌物质，收集 ASL。

检测乙酰甲胆碱刺激产生的 ASL 的抗菌作用，衡量指标：菌簇形成单位（colony-forming unit，CFU）。

结果：CF 猪分泌的 ASL 杀菌能力不及 non-CF 猪 (Fig. 1f)。

二、细胞实验

实验 1

操作：包埋 S. aureus 的金网格薄片置于原代培养的猪气道上皮细胞。

结果：CF 猪来源的上皮细胞抗菌能力不及 non-CF 猪来源的 (Fig. 1 g)。

实验 2

换一种菌试试，Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌），结果同前 (Fig. 1 h)。

实验 3

操作：直接将 S. aureus 加到培养的上皮表面。

结果：细菌数量少时，non-CF 猪的可清除，CF 猪的感染 (Fig. 1i)；细菌数量多时，两者都感染。

以上，ASL 有快速杀菌能力，CF 此能力受损。杀伤缺陷可能源于 ASL 中抗菌物质数量的减少或功能的受阻。

知识点

呼吸道上皮细胞气液界面（air-liquid interface,ALI）培养。

本文用这个培养体系在体外模拟气道上皮产生的 ASL 用于下一步的研究。

图：人气道上皮在半透膜上培养，投射电镜下的显微结构。上层空气，ASL 位于其余上皮之间。上皮结构分化出纤毛（→），杯状细胞（G），基底细胞和纤毛状细胞（C）。

第二幕 ASL 中抗菌物质的数量不是元凶

一、是否为 ASL 抗菌物质的表达，转录和翻译差异？

实验 1. 转录产物，分别用基因芯片和定量 RT-PCR 检测，表达没差异 (Table S1, Fig. S1)

实验 2. 宿主防御相关蛋白基因，表达没差异 (Table S2)

实验 3. 乙酰甲胆碱刺激产生的 ASL，含量最丰富的抗菌物质，lysozyme（溶菌酶）和 lactoferrin（乳糖肝褐质），PLUNC 和 SP-A，没差异 (Fig. 2a)。

二、排除数量表达差异后，是否为抗菌物质聚集能力的差异？

为强化抗菌能力，将离子强度降为接近 0.

实验 1. 木糖醇（xylitol）液加到培养气道上皮细胞表面，ASL 稀释 100 倍；

实验 2. 从培养的气道上皮细胞表面用 100 ul 水冲洗下来的 ASL；

实验 3. 乙酰甲胆碱刺激猪气道产生的 ASL，用水稀释 100 倍；

实验 4. 径向扩散法（radial diffusion assay）。

都表现为同等的杀菌能力 (Fig. 2b-2e)。

综上，排除 ASL 抗菌物质的数量差异的影响。

第三幕 ASL 中的离子浓度会干扰吗？

背景：离子强度增加会降低许多种抗菌物质的活性，但 CF 中离子浓度是高还是低没有定论。

实验 1. 测量不同基因型新生猪 ASL 的 Na+ 和 K+ 的浓度，无差异。(Fig. 3a)

实验 2. 乙酰甲胆碱刺激产生的 ASL，与未刺激状态无差异。K+的浓度在 CF 和 non-CF 间有细微差异。(Fig. 3b)

综上，Na+和 K+的浓度不能解释 CF 抗菌能力的下降。

第四幕 ASL 中的 pH 才是问题关键

背景：人和猪气道上皮 HCO3-的分泌表现为 CFTR 依赖，CF 的 ASL pH 明显降低。

现象 1. 体内测 ASL pH，平面 pH 敏感探针（planar pH-sensitive probe），CF 更低 (Fig. 3c)

现象 2. 体外测乙酰甲胆碱刺激产生的 ASL pH，pH 光学探针（optical pH probe），CF 更低。(Fig. 3d)

现象 3. 测原代培养的上皮细胞 pH，pH 荧光指示剂（fluorescent pH indicator），CF 更低。(Fig. 3e)

验证 ：pH 是否影响 ASL 抗菌能力？

实验 1

从 non-CF 小猪得到乙酰甲胆碱刺激产生的 ASL，HCl 调整 ASL pH，包埋 S. aureus 的金网格测其杀菌能力，杀菌能力随 pH 降低而减弱。(Fig. 4a)

空白对照 含 100 mM HEPES 的溶液，调整 pH。 (Fig. S3)

实验 2

用 S. aureus Xen29 (Fig. 4b) 荧光标识，分别测试 pH 是否影响 lysozyme（溶菌酶）和 lactoferrin（乳糖肝褐质）的杀菌能力。可见相对对照组荧光强度的相对光单位（relative light unit, RLU）随 pH 增高而减少。

实验 3 在体内证实 pH 对气道杀菌能力的影响。

推测：降低野生型猪的 ASL pH 减弱其杀菌能力，而升高 CF 猪的 ASL pH 可恢复其杀菌能力。

验证：

实验组 1 在 non-CF 猪，通过增加气体 CO2，降低 ASL pH，果然杀菌能力减弱。(Fig. 4c)

实验组 2 在 CF 猪，通过雾化 NaHCO3，增高 ASL pH，果然杀菌能力增强。(Fig. 4d)

最终，从体内、ASL 和原代培养的上皮细胞三个层面探讨 pH 降低会影响抗菌物质的杀菌能力。全剧终。

统计分析

又双叒叕来到了这个环节，但笔者惊讶的发现，只有三句话。数据用均数±SEM 表示，非配对 t 检验，P < 0.05。与临床研究的文章相比，笔者流下了感动的泪水。

后记

其实早在 2008 年，Michael Welsh 领导的实验室就在 science 上发表了 CF 模式猪，解决了老鼠造模不典型的问题。正因为疾病模型的出现，为以后的研究打下了良好的基础。其后更在 2016 science 中回答了老鼠造模失败的原因。除了自建模型，活体杀菌能力测量的脑洞也是该文的亮点之一。

笔者目前主要进行临床研究学习，作为基础研究的门外汉，窥觑这国自然的光辉，大胆写下这个专题。不当之处，请各位大神多多指正。或许应该回过头看看为何别人可以双弹齐发，枪林弹雨，而我们却是小鸡啄米。

下期继续讲述 Nature & Science，如何双弹齐发？（下篇），顺便侃侃 Michael Welsh 的实验室。不甚其烦笔者小白笔触的，敬请期待!

详细版将发布在丁香园论坛。您可以了解菌金属网格的制作流程，生物素-链霉亲和素系统，荧光死菌/活菌染色计数，呼吸道上皮细胞气液界面培养体系，基因芯片和定量 RT-PCR，RIN，cRNA，ΔΔCt，离子强度，如何测 ASL Na+、K+ 浓度，为什么要考虑蒸发的影响以及如何去除，各种情况下如何测 pH 和调节 pH，如何花样证明杀菌作用，CFU 法和径向扩散法等。

另外感谢网上四面八方搬砖墙友曾几何时的问答，特别鸣谢丁香园。（END~）

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