养细胞就跟养娃一样，过来人告诉你几点经验

养细胞是一件扎心的事，可以让你提前有种为人父母的感觉，你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她，给她温暖。除此之外，你还要有足够的技巧去驾驭她。

比如，想要长期持有一个细胞系，最佳的策略是进行低温保存。这可以有效防止因污染或技术原因导致的细胞损失。而低温保存对于维持细胞株的遗传特性也极为重要。

看似简单的冻存细胞，如果操作不当，将导致长期培养的细胞付之东流。作为一个吃过亏的人，告诉你细胞冻存是否成功取决于以下四个关键因素。

适当的处理及温和收集细胞

冻存前检查

冻存前，细胞应处于指数生长期，确保细胞处于健康状态。理想情况下，应在收获细胞前 24 小时更换培养基。建议对培养物进行微生物污染物，特别是支原体的检测，并通过适当的方法，如 STR 分析确定其身份。

如果在培养过程中使用抗生素，那么建议在冷冻前 1 到 2 周不使用抗生素，这样如果出现污染，可以更容易地发现。

收集细胞

通常，您可以使用常规用于细胞传代的实验程序来收获细胞。细胞收获期间尽可能温和操作。本程序推荐的试剂量是针对为 75 平方厘米（T-75）培养瓶；若使用其他培养容器，请相应调整所用试剂量。

1. 使用无菌吸管，取出并丢弃培养基。请妥善处置与细胞接触的任何材料和溶液。

2. 用 5 到 10 ml CMF-PBS 冲洗细胞，去除所有痕量的血清。

3. 加入 3 到 5 ml 的胰酶（在 CMF-PBS 中），37℃ 孵育。预热酶溶液通常会缩短处理时间。

4. 在倒置相差显微镜上每隔几分钟检查酶处理的进展情况。一旦细胞变圆，轻轻敲击细胞瓶使其脱离塑料表面。加入 5 ml 含血清的生长培养基灭活胰酶。可能需要剧烈的移液操作来使培养容器底部的剩余细胞脱落，或将细胞团块分解成单细胞悬浮液。胰酶的去除或失活对于冷冻细胞至关重要。如果游离试剂不能直接灭活，可以通过下一步的离心去除。

5. 用 15ml 离心管收集细胞。取出样本进行细胞计数，剩余的细胞悬液以约 100×g 离心 5 分钟以获得细胞沉淀。离心时，用细胞计数板对细胞进行计数。使用台盼蓝染液检查细胞的活性。

使用合适的冷冻保护剂

5%～10% 的甘油和 DMSO 是最常见的冻存保护剂。虽然 DMSO 对细胞有毒性，但是与甘油相比，其渗入细胞的速度更快，而且冻存重复性更好（细胞复苏效率更好）。

但是，DMSO 一方面会导致某些细胞（如 HL-60 早幼粒细胞）分化，另一方面对某些细胞（如 HBE4-E6/E7 肺上皮细胞）的毒性也过大。对于这些细胞，则应使用甘油。甘油可以通过高压蒸汽灭菌，而 DMSO 只能通过过滤除菌。DMSO 或者甘油至少应达到试剂级（或者更高级别，如细胞培养级），并且分装，避光保存。

细胞冻存的速率

有很多方法可以实现 1℃/min 的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统是最好的方式，可以精确保持降温速度。这也是 ATCC 唯一采用的方法。但这种设备价格较高。比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中，在低于 –70℃ 的冰箱中冻存 24 小时。已有一些商业化冻存盒产品能够非常接近 1℃/min 的理想降温速度。

合适的储存温度

长期保藏需要超低温（低于 -130℃）环境，可以使用低温冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。

要维护液氮中储存的细胞需要记住以下几点：

1. 确保标签系统适用于（永久）低温储存。

2. 保持良好记录，包括细胞储存位置，生长特点和操作记录。

3. 请频繁检查液氮罐的状态（最好每天或至少每周一次）。有多种商用警报系统可用于持续监控其状态。珍贵细胞应至少存放在两个不同的地点。