3 个关于 MTT 实验的细节
生物学霸
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做 MTT 实验容易走弯路。此前我们汇总过部分 MTT 实验相关细节，可点击阅读原文查看。今天继续和大家一起来谈谈
MTT 实验步骤
贴壁细胞相关实验操作
1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100 uL 铺板使待测细胞调密度至 1 000-10 000 孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。
2. 5% CO2，37℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般 5-7 个梯度。每孔 100 uL，设 3-5 个复孔。建议设 5 个，否则难以反应真实情况。
3. 5% CO2，37℃ 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。
4. 每孔加入 20 uL MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5% MTT），继续培养 4 h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。
5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6. 每孔加入 150 uL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490 nm 处测量各孔的吸光值。
7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞相关实验操作
1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1 000 000/mL，按次序将以下 4 种共 100 uL 加入到 96 孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。
补足的 1640（无血清）培养基 40 uL。
加 Actinomycin D（有毒性）10 uL 用培养液稀释 10 g/mL，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）。
需检测物 10 uL。
细胞悬液 50 uL（即 5×10000 cell/孔）
2. 置 37℃，5% CO2 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。
3. 每孔加入 10 uL MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5% MTT），继续培养 4 h。（悬浮细胞推荐使用 WST-1，培养 4 h 后可跳过步骤 4），直接酶联免疫检测仪 OD570 nm（630 nm 校准）测量各孔的吸光值。
4. 离心（1000 转 x10 min），小心吸掉上清，每孔加入 100 uL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570 nm（630 nm 校准）测量各孔的吸光值。
5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。
MTT 的配置
MTT 一般最好现用现配，过滤后 4℃ 避光保存两周内有效，或配制成 5 mg/ml 保存在 -20 度长期保存，避免反复冻融。最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多, 尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT 有致癌性，用的时候小心, 有条件最好带那种透明的簿膜手套。配成的 MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感。往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
配制 MTT 时用 PBS（pH=7.4）溶解， 也有人用生理盐水配，60℃ 水浴助溶。PBS 配方：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2 HPO4 1.44 g、KH2PO4 0.24 g，调 pH7.4，定容 1L。
个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的 MTT 的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的 MTT 之间的关系确实不好确定，我认为 MTT 多加一些比少加好一些。
MTT 的量各家报道不同，一般是过量的，所以 10 uL 足够。如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 uL，MTT 按照 10% 的比例加入。加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀，不过这个应该关系不大。
如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性极大，另外 MTT 稀释后加入细胞前还是需要以过滤的方式灭菌为宜。 且在加 MTT 前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌。
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和 MTT 加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培养液，直接加 MTT 即可。
加入 DMSO
在同一批实验中最好不要更换 DMSO。加 DMSO 前把孔中液体尽量弃干净。没有去掉上清直接加 DMSO，一是沉淀会很难溶解，二培养液的颜色在检测时也能被测到，会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差，所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。
如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO 的量也可为 100 uL 或 150 uL。
加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5－10 min，时间控制尽量严格一点，放置时间长了会影响结果，值会偏大，且结果不可信。
加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。
放入 37℃ 放孵箱 15 min 溶解结晶。
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作者：ftfsunny
题图来源：网络
