基因功能研究第一步：轻松敲基因
丁香园
基因研究中，敲除基因，研究该基因的功能是最常用的套路。一般 ShRNA 可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达， 是基因研究中必不可少的环节。下面就主要围绕设计 ShRNA 引物序列，手把手教你构建 ShRNA 质粒，轻松敲基因。
ShRNA 的设计原则
1. 克隆到 ShRNA 表达载体中的 ShRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ 启动子控制。随后在连上 5～6 个 T 作为 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。
2. 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点。
3. ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。
4. 5～6 个 T 必须放置在 ShRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶 III 终止转录。
5. 在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T。这可能导致 ShRNA 转录的提前终止。
下面以 pSUPER 质粒载体设计 ShRNA 为例：
1. 选择双酶切位点分别是 BglII-HindIII site。
2. pSUPER ShRNA design model：红色部分包含限制性酶切位点，绿色部分为茎环序列。
3. shRNA 的引物设计呢，可以从 Sigma 网站上进行查询。
（1）进入 sigma 网站，点击 search for shrna clones。
（2）在对话框输入基因名称。
（3）在基因 products 里面找到 shrna panels，点击进入。
（4）根据自己所要敲除的物种，human 或者 mouse，点击价格进入。
（5）如图，得到 shrna 序列，一般左上角带有 VALIDATED 标志的序列，为已知验证序列，而且还可以看到平均敲减效率为 0.66。可优先选择已验证并且敲减效率高的引物序列。
（6）选择第一条，得到如下序列，一般由于构建质粒载体不同，酶切位点也有所不同，sigma 官网的引物起始碱基 CCGG 是酶切位点序列，TACTCGAGTA 是茎环结构，TTTTT 是 RNA 聚合酶 Ⅲ 的转录终止子。所以我们只选择序列中所要敲除的特异基因序列，即黄色部分。
所以我们构建的 BCL2 shrna 引物序列即为：
注意：一般根据目的 mRNA 序列设计 3 条 ShRNA 序列，验证敲除效率最优的 ShRNA 进行实验。
4. 模板合成：合成每条编码 shRNA 的单链 DNA 模板，退火形成 DNA 双链。模板链后面连接 RNA PolyIII 聚合酶转录终止位点，且两端分别设计酶切位点。
5. pSUPER 载体进行 BglII，HindIII 的双酶切。获得线性质粒载体。
6. DNA 双链和病毒载体的连接。
7. 连接产物的转化。
8. 测序验证 ShRNA 序列是否连接到载体。
9. 将质粒转染细胞验证 ShRNA 敲减效率。
以上是 shRNA 的茎环引物设计方法，在构建其它慢病毒或者腺病毒质粒时，方法是通用的。但是，对于以下几种情况：（1）不同的质粒，（2）选用不同的限制性内切酶，（3）连接质粒时选用重组或者黏性末端连接等不同方法，又需要根据自己的实际情况在短序列两端添加相应的酶切位点序列以及保护碱基等。
