2 招轻松应对投稿时编辑对抗体特异性的质疑
丁香园
实验室大师姐是位学霸，这学期结束就要毕业了，她奋起神勇准备发一篇高分的文章，也算是自己学生生涯的完美总结和对自己的交代。经历了九九八十一天的废寝忘食实验后，大师姐信心满满的给某 SCI 影响因子分数颇高的杂志投递了自己的文章，结果却收到了杂志编辑如下的提问回复：
无独有偶，以 nature 系列杂志为例，提交论文需要完成 reporting summary 的一系列问题，其中有一个必答问题如下：
9. Antibodies
Describe the antibodies used and how they were validated for use in the system under study （i.e. assay and species）。
类似对抗体验证（抗体特异性）的质疑不再仅限于 science，nature 等高分杂志，由于生物试剂普遍存在的特异性问题导致实验结果不可重复1，已经引起主流学术期刊的关注。编辑们正逐渐提高对抗体特异性问题的重视，并要求提供抗体特异性的证据。
事实上，抗体的特异性问题，就是我们常说的「脱靶」。市面上抗体的品质良莠不齐，有相当一部分抗体并不能正确识别您想研究的靶标。想想是不是有些可怕？！使用这些「脱靶」抗体，如果您的检测结果为阴性，那就极有可能错失您苦苦寻觅的信号；如果您的检测结果为阳性，那么您的实验结论则完全不成立，需要推倒重来！！！这要是到了最后投文章的时候才意识到可能的隐患，那情况就相当尴尬了。
目前，纵观市场上商业化抗体厂商，能够提供特异性证明的屈指可数。我们常见的 WB 验证、IHC 验证、流式验证事实上仅为应用有效性验证，并不能排除抗体的非特异性结合。简单的说，此验证非编辑所要的「验证」！那么到底什么样的验证才是抗体特异性最有效证明呢？
根据 Nature Methods 2016 年的文章2，国际抗体验证工作小组（International Working Group on Antibody Validation, IWGAV）提出 5 种支柱策略（conceptual pillar），如下：
1. 基因策略（敲除验证）：利用 CRISPR/Cas 或 RNAi 等技术对靶基因进行敲除（knock out）或敲低（knock down），分别检测对照组与 KO 组的信号。
2. 正交策略：在多种样品中使用一种与抗体无关的定量方法，然后比较分析基于抗体的定量方法与抗体无关的定量方法之间的相关性。
3. 独立抗体策略：使用两种或多种抗原表位不同的抗体，通过比较和定量分析来验证抗体的特异性。
4. 标记蛋白表达：在内源靶基因上加入标签或荧光蛋白。比较分析蛋白标记的信号与基于抗体方法的检测信号的相关性。
5. 免疫捕获后进行质谱分析：免疫捕获（IP）溶液中的靶蛋白，然后进行质谱分析，鉴定与抗体直接作用的蛋白，以及可能与靶蛋白相互作用的蛋白。
在这五种验证方法中，敲除验证（knock out validation）是最有力，最为广泛接受的特异性验证方法。靶基因被敲除后，目标蛋白不会存在于样品中，因此成为绝佳的阴性对照。与对照组一起进行对比试验，抗体是否特异则一目了然。
以近期热门的 PD-L1 抗体为例：
上图显示了对野生型 L2987 细胞（左图）和 PD-L1 基因敲除 （KO） L2987 细胞系（右图）使用抗 PD-L1 [28-8] RabMAb® 抗体（ab205921）的染色情况。利用 TALEN 编辑 L2987 结肠直肠癌细胞系中的 PD-L1 基因，靶向人 PD-L1 的第 4 外显子。通过深度测序可确认 KO 已完成。记得哦，这才是杂志编辑想要的特异性证明！
使用经过敲除验证的抗体来进行靶标的检测，结果更令人信服。
因此，建议所有抗体使用者在购买抗体时关注特异性数据，以下两招请务必牢记：
1. 厂商是否提供敲除验证数据（KO validated），如果有，可以放心使用；
2. 如果没有此数据，可以查阅相关文献是否有以上特异性验证相关的实验数据，尽可能选择有验证数据支持的抗体。
以上第一种情况，可以顺利通过编辑审查，如下：
范例回复，来源神经所的 Nature 文章3：
Abcam 已拥有 1,000+ 高品质抗体，通过了业内最严格的敲除验证（KO validation），也是抗体业仅有的 1,000 多个通过「敲除验证」的高品质商业抗体！
第二种情况，相对复杂，需要引用别人已发表的敲除验证的数据。
请注意，并不是引用的文献越多越好，而是要有至少一篇证明抗体特异性的文献。以下以发表在 Cell Report 上 CFP1 靶点研究文章4 为例。
这篇文章研究的是不孕症里的一种卵母细胞不能完成发育的情况，涉及到基因信息的传递和表观遗传学的机制。其中组蛋白修饰 Histone modifications 是卵母细胞在发育中的关键步骤，该研究应用了卵母细胞的 CFP1 条件敲除小鼠来研究早期胚胎发育中 H3K4me3 的调控作用。
由上图可见，WB 检测 GV 期和 MII 期 CFP1 的表达，而敲除后 CFP1 条带微弱，证明了抗体的特异性。
这就是 editor 要的抗体验证哦！
如果您也使用了这个抗体，就可以引用这篇文章来作为抗体验证的证据回复 editor 啦。
为了方便用户使用 Abcam 高品质抗体，Abcam 举办了「KO 文献有奖反馈」活动，已有 24 篇 Pubmed「KO」文献等你引用，具体如下：
由于 Abcam 在抗体验证上的卓越成就，国际抗体行业权威媒体CiteAb今年年初授予了 Abcam「最佳抗体验证奖」。
参考文献：
1. Baker,M.1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature. 2016 May 26;533（7604）：452-4. （PMID: 27225100）
2. UhlenM, Bandrowski A, Carr S, Edwards A, Ellenberg J, Lundberg E, Rimm DL, RodriguezH, Hiltke T, Snyder M, Yamamoto T.A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 2016 Oct;13（10）：823-7. （PMID: 27595404）
3. Yin JA, Gao G, Liu XJ et al. Genetic variation in glia-neuron signalling modulates ageing rate. Nature. 2017 Nov 8;551（7679）：198-203. （PMID: 29120414）
4. Yu C et al. CFP1 Regulates Histone H3K4 Trimethylation and Developmental Potential in Mouse Oocytes. Cell Rep. 2017 Aug 1;20（5）：1161-1172. （PMID: 28768200）
