实验时间 | Transwell 侵袭实验总结

我的课题涉及 Transwell 侵袭实验，因此在这里和大家分享 Transwell 侵袭实验。

实验用品

我用的是 ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和 75% 酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照 30 min。处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低档，30 min，清水 3×5 min，蒸馏水 3×5 min，室温凉干，用前紫外线小室正面 3 h，反面 6 h，微波，低火 10 min×2。

因为我买的是铺好胶的，所以没买 Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的 Chemicon ECM550 系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次。

Transwell 小室用过后，可把原来的膜切下，贴上 osmonic 公司的膜，这样又可以用了，有兴趣的可以试试。使用方法：trasnwell 小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将 osmonic 公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入 0.05%-0.2% BSA。

有侵袭能力的细胞才可用于 Transwell 侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测 MMPs 的表达，特别是 MMP-2 的表达。如果不清楚细胞 MMPs 的表达情况，就盲目进行 Transwell 侵袭实验，可能会造成不必要的浪费。

另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿 12－24 h，再进行实验。

常用的是人工重构基底膜材料 Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和 Ⅳ 型胶原。Matrigel 是一种细胞外基质，4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在 sigma 叫 ECM。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么 Matrigel 就不需要购买了。

下层常用含 5%－10% FBS 的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高 FBS 浓度。下层也可用趋化因子，也可将将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但我认为 FBS 仍是最合适的。

常用于 Transwell 侵袭实验的细胞培养板有6 孔板、12 孔板、24 孔板等，以 24 孔最常用。需注意，细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套。

此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白（fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。

很多人认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。也有人认为，如果培养时间很长（>24 h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上 FN。

另外，膜下层涂上 FN 还有一定的趋化作用。

实验步骤

1. 1 无基质胶 Transwell 小室制备

① 包被基底膜

用 50 mg/L Matrigel 1:8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜的上室面，4℃ 风干。如果需要在下室面铺 FN 的话，可将 200 μL 枪头的尖端剪掉，吸取 FN 均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0.5 mg/mL，直接用枪吸了涂在膜上。

② 水化基底膜

吸出培养板中残余液体，每孔加入 50 uL 含 10 g/L BSA 的无血清培养液，37℃，30 min。

另一方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的 Matrigel （3.9μg/μL）60-80 μL （注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），置 37℃ 30 min 使 Matrigel 聚合成凝胶。

1. 2 有基质胶的 Transwell 小室制备

按照 ECM550 系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入 300 μL预温的无血清培养基，室温下静置 15－30 min，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。

1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1－2 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1-10×100 000，个人认为不要超过 5×100 000。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数。而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

对照组和处理组尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

1. 取细胞悬液 100－200 μL 加入 Transwell 小室，不同公司的、不同大小的 Transwell 小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24 孔板小室一般 200 μL。

2. 24 孔板下室一般加入 500μL含 FBS 或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

3. 培养细胞：常规培养 12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用 MTT 筛选出的 72 h 的 IC50。用这个浓度处理细胞，24 h 内对细胞增殖并无明显抑制，但 24 h 后，抑制作用就开始出现了。

所以，用这个浓度来做 Transwell，处理时间也必须限定在 24 h 内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。

时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的 MMPs 储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响 MMPs 表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。

另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。

在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。（作者：@丁香园站友 lwjssry）