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手把手教你学会肿瘤动物模型的构建

丁香园

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基础研究中如果加入动物实验部分则使得研究更加趋于完善,投稿时中稿率也相应会增加。但将动物实验做好却不是一件容易的事情。

常用见的动物实验是肿瘤动物模型的构建,一般包括小鼠移植瘤模型和转基因动物模型。小鼠移植瘤模型根据移植方式又包括了皮下种植移植瘤,肾被膜下种植移植瘤和原位种植移植瘤。

转基因动物模型则是引入致癌基因或敲除抑癌基因建立自发肿瘤或诱导生成肿瘤的转基因模型小鼠,再在模型小鼠的基础上进行相应的实验。本文我们主要探讨小鼠移植瘤模型的建立的心得体会,以后再谈论关于转基因小鼠模型建立方面的问题。

01 第一类是皮下移植瘤

顾名思义,这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。种植的点也有讲究,一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。可根据实验设计选择移植点,统一移植点的位置,除了遵守实验统一的条件外,待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。

裸鼠(Balb/c 鼠, 无毛发, T 淋巴细胞缺陷)是比较常见和常用的实验用鼠,尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。当然,这种肿瘤模型也有缺陷,即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。

☞ 肿瘤细胞移植时的简要步骤

首先准备好要移植的肿瘤细胞(细胞量根据不同肿瘤略有不同,我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择 1x106 左右;肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取,基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境,有助于肿瘤细胞生长)。

戴无菌手套后,将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤,然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次。右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器,在腹股沟或腋窝的位置,45 度斜角进针,注意不要突破腹膜,将针头保持于皮下位置。

然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下,将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下(肿瘤细胞量约 1x106),快速退针,左手食指轻压针孔约 1 min 后将小鼠放回饲养笼中,注意将小鼠侧放于垫料上,放置其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。2~3 h 后观察小鼠是否苏醒。

如果是利用肿瘤组织(人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代)建立裸鼠皮下移植瘤模型,则需要首先将肿瘤组织用无菌 PBS(或 1640 培养基)洗涤 3 次,然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成 < 1 mm3 体积的小块(种植前可裹基质胶)备用。

将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上,四肢用胶带固定,将腋窝或腹股沟用 75% 酒精消毒 3 次,然后用眼科剪剪开约 0.5 cm 小口,小镊子将皮下筋膜与皮肤分开,然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部,每个位置放置 2~3 块肿瘤组织,注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。

然后缝合皮肤,消毒后将小鼠侧卧位放置于饲养笼的垫料上。2~3 h 后观察小鼠是否苏醒。

☞ 影响皮下移植瘤肿瘤形成因素

1. 移植肿瘤细胞的生长状态:肿瘤细胞应选取传代后汇合度达 60%~80% 为最理想状态,此时细胞生长进入对数期,生长速度最快,状态最为理想,易于形成移植瘤。

2. 肿瘤细胞收集后种植到小鼠皮下不宜时间过长,应尽快种植到小鼠体内,我们一般在 2 h 内完成。

3. 裹有基质胶的肿瘤细胞种植比单纯的肿瘤细胞种植更易成瘤。基质胶为肿瘤细胞在接受宿主营养之前提供充足营养环境,起到桥梁的作用。

4. 肿瘤组织移植种植时,应将肿瘤组织切成 1 mm3 的小块,过小或过大均不利于肿瘤形成,组织块过大时不利于肿瘤组织中的肿瘤细胞接触新的环境生长,组织块过小时则肿瘤细胞过少,大部分在切块时破坏,均不利于肿瘤形成。

另外从肿瘤组织离体到种植到小鼠皮下不宜时间过长,我们一般在 4 h 内完成移植种植。

02 第二类是肾被膜下移植瘤模型

肾被膜下血运较为丰富,比较适合那些对肿瘤营养环境要求苛刻的肿瘤细胞。

用于肾被膜下移植瘤的小鼠主要是 NOD-SCID 鼠(SCID 鼠与非肥胖糖尿病鼠(nonobese diabetic,NOD)杂交而来,T 和 B 淋巴细胞、抗原呈递细胞、循环组分及部分 NK 细胞缺陷),这种小鼠表型为白色毛发小鼠,对于饲养条件较为苛刻,需要无菌的 SPF 级饲养环境。

不易成瘤的肿瘤组织一般选择肿瘤肾被膜下种植移植瘤模型。建立模型时,同样首先需要将肿瘤组织用无菌 PBS(或 1640 培养基)洗涤 3 次,然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成 < 1 mm3 体积的小块(种植前可裹基质胶)。

将小鼠用水合氯醛麻醉后俯卧于解剖板上,四肢用胶带固定,在肋脊角靠下的位置剪去约 1.5 cm 直径的皮肤毛发以备皮。75% 酒精消毒 3 次,用眼科剪将皮肤剪开约 0.5 cm 小口,依次分离皮肤、皮下、侧腹膜。

找到肾脏位置,小心仔细将肾脏提至皮肤切口出,用小尖镊子戳开肾被膜一小口,仔细将小块肿瘤组织送入肾被膜下,一般 2~3 块。然后将肾脏送回腹腔,依次缝合腹膜、皮下组织和皮肤。消毒后将小鼠放回饲养笼内。2~3 h 后观察是否苏醒。

☞ 影响肾被膜下移植瘤肿瘤形成因素

1. 肿瘤组织处理是否恰当,除和皮下移植瘤相同处理外,应注意多裹些基质胶在肿瘤组织小块上,在塞进肾被膜下时应尽量注意尽量保持肾被膜完整。我们曾单纯将肿瘤组织种植到肾被膜下,成瘤率较低,而裹有基质胶的肿瘤组织较易成瘤。

2. 注意手术时及时找到出血点并及时止血,侧腹膜解剖时损伤,误伤肾脏、肾脏血管等,如不及时处理,很容易引起出血过多导致失血性休克。尤其是阴性出血不易察觉,在第二天查看小鼠情况时发现小鼠已死亡等。

3. 手术器械需灭菌消毒,操作台需要无菌环境,避免因感染引起术后小鼠死亡。

03 第三类是原位移植瘤模型

为了更好的模拟肿瘤的生长情况选择发生肿瘤的器官为移植点。常用的小鼠仍为 NOD-SCID 鼠。采取开放手术打开暴露相应的发生肿瘤的对应的小鼠器官,将肿瘤组织或肿瘤细胞种植到器官内。此方式因不易操作,且小鼠手术后死亡率较高,一般不常选用。

小鼠实验分组一般 5 只以上为一组,分别设置实验组和对照组。术前将小鼠于动物房饲养一周适应环境,术前术后称量记录体重。小鼠移植瘤一般 2 w 左右即可形成,可用游标卡尺记录瘤体长短径,每周 3 次记录。一般待瘤体体积为 1 cmx1 cm 时处死小鼠,收集肿瘤接着在小鼠身上传代处理或进行其他实验验证。

小鼠实验肿瘤动物模型构建关键要细心,尤其是肿瘤细胞选择,肿瘤组织块处理上要仔细认真,这是影响模型成功建立的关键,还有移植手术时更要耐心细致,不要还没有建立就已经失败。

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