最全的 MTT 实验经验大汇总
丁香园
做 MTT 走了不少弯路,后来看了很多的资料,再做的时候结果好了很多。因此特别将有用的内容整理出来,分享给大家。可以点击阅读原文查看完整版。
实验前应明确的问题
1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 100000 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2. 药物浓度的确定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值,输入 excel 表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线。曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
4. 200 ul 的培养液对于 10 的 4~5 次方的增殖期细胞来说,很难维持 68 h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止,影响结果,我们是在 48 h 换液的。
MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做 MTT 时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。
5. 实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
6. 避免血清干扰。用含 15% 胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于实验本底增加,会有实验敏感性。因此,一般选小于 10% 胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
细胞的接种
1. 吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的 3-4 倍,可能比较容易混匀。10 ml 的离心管里面最好装 3~4 ml 的悬液。悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。
2. 吸管的吸液量最好在 1 ml 左右。吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量 1 ml 多的吸管,总液量在 5 ml 左右为益。
3. 吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
4. 吹打次数 100 左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打 30-50 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次,每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。
我习惯每块板加完后平握手中,向左 3 下,向右 3 下,再往返回复 3 下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。铺板技术是 MTT 实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。
如何移除上清
1. 加 DMSO 前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去。可在这之前先用平板离心机离心 96 孔板,2 000 r,5 分钟,然后吸掉上清。
如果是悬浮细胞,则推荐此法。悬浮细胞要离心 2500 rpm ×10 min,且其做 MTT 最好用圆底型 96 孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃 150-160 ul 即可。
2. 我每次将 MTT 加入后,再孵育四个小时,然后用离心机离心 1 000 G,5 min。但是用枪小心地吸上清,还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法。
3. 可以直接将板翻转倒扣(垫几层滤纸)2-3 次,比用「吸」的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍,或者倾斜一点帮助吸液,发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱,但前提是你本身细胞贴壁要比较牢,半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话,阴性对照组可能由于细胞过多而使加入 MTT 后形成的结晶漂起来,这样就不能直接倒掉上清。
4. 做 MTT 时,这一步骤一定要小心,不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉,从而影响 OD 值。悬浮细胞,不要翻板,离心后也不要翻板,这个方法害死人。
5. 加完 MTT 反应 3-4 h 后,从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔,避免振荡结晶,使其滑落。 你可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角,然后用枪尖慢慢吸,有的细胞可以用排枪一起吸,有的则要耐心的一个个用枪头吸,枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底,且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平,这样也会使结晶脱落。
6. 用医用的注射器加上针头吸取液体的,吸取时要把板子斜放,沿着壁吸取就好。这次 MTT 我用 1 ml 针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶。
本文作者系丁香园站友 @ftfsunny