最全的 MTT 实验经验大汇总

做 MTT 走了不少弯路，后来看了很多的资料，再做的时候结果好了很多。因此特别将有用的内容整理出来，分享给大家。可以点击阅读原文查看完整版。

实验前应明确的问题

1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 100000 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2. 药物浓度的确定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线。曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4. 200 ul 的培养液对于 10 的 4～5 次方的增殖期细胞来说，很难维持 68 h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48 h 换液的。

MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。

5. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

6. 避免血清干扰。用含 15% 胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于实验本底增加，会有实验敏感性。因此，一般选小于 10% 胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

细胞的接种

1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3～4 倍，可能比较容易混匀。10 ml 的离心管里面最好装 3~4 ml 的悬液。悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

2. 吸管的吸液量最好在 1 ml 左右。吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量 1 ml 多的吸管，总液量在 5 ml 左右为益。

3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

4. 吹打次数 100 左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 30～50 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次，每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）

5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。

我习惯每块板加完后平握手中，向左 3 下，向右 3 下，再往返回复 3 下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。铺板技术是 MTT 实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。

如何移除上清

1. 加 DMSO 前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去。可在这之前先用平板离心机离心 96 孔板，2 000 r，5 分钟，然后吸掉上清。

如果是悬浮细胞，则推荐此法。悬浮细胞要离心 2500 rpm ×10 min，且其做 MTT 最好用圆底型 96 孔板，清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉，建议各孔吸弃 150-160 ul 即可。

2. 我每次将 MTT 加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心 1 000 G，5 min。但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法。

3. 可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）2～3 次，比用「吸」的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入 MTT 后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。

4. 做 MTT 时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉，从而影响 OD 值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。

5. 加完 MTT 反应 3～4 h 后，从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶，使其滑落。 你可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。

6. 用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好。这次 MTT 我用 1 ml 针头仔细吸培养液，觉得比其它方法可靠，一般不会吸走紫色结晶。

本文作者系丁香园站友 @ftfsunny