实验时间 | 还在为凝胶迁移实验（EMSA）发愁？老司机为你指路

如下设置探针标记的反应体系：体系为 10 微升

待标记探针 （1.75 pmol / 微升） ：2 微升。

T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10×） ：1 微升。

Nuclease-Free Water ：5 微升。

[γ-32P] ATP（3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml） ：1 微升。

T4 Polynucleotide Kinase （5-10 u / 微升） ：1 微升。

依次加入各种试剂，加入同位素后混匀，再加入 T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

使用水浴或 PCR 仪，37 ℃ 反应 10 分钟。

加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在 30% 以上，即总放射性的 30% 以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。

对于 100 微升标记好的探针，加入 1/4 体积即 25 微升的 5 M 醋酸铵，再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇，混匀。

在 -70 ℃ 至 -80 ℃ 沉淀 1 小时，或在 - 20℃ 沉淀过夜。

在 4 ℃，12 000 g～16 000 g 离心 30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

在 4 ℃，12 000 g～16 000 g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

加入 100 微升 TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用。

准备好倒胶的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，便于干胶等后续操作。

配制 20 毫升 4％ 的聚丙烯酰胺凝胶。

加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

如下设置 EMSA 结合反应

（1）阴性对照反应：体系为 10 微升；Nuclease-Free Water ：7 微升；EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5×）：2 微升；细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升；标记好的探针 ：1 微升。

（2）样品反应

（3）探针冷竞争反应

（4）突变探针的冷竞争反应

（5）Super-shift 反应

加入标记好的探针前先混匀，并且室温 （20～25 ℃） 放置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温放置 20 分钟。

加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液 （无色，10×），混匀后立即上样。

用 0.5×TBE 作为电泳液。按照 10 V / 厘米的电压预电泳 10 分钟。预电泳的时若有空余上样孔可加入少量稀释好的 1× 的上样缓冲液，以观察电压是否正常。

把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。

按照 10 V / 厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过 30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电泳。

剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有 EMSA 胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。把滤纸从 EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个 EMSA 胶，滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后揭起滤纸。把滤纸侧向下放平，在 EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

干燥 EMSA 胶。然后用 X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。