几番摧残，科研小白终于注意到提取 RNA 的这些操作细节！

刚开始 Trizol 法提 RNA OD 值 260 / 230 要么太低（1.4 - 1.6），要么太高（2.1 - 2.2），一段时间的摧残过后，终于可以总结出一些操作细节供参考。

1. 举例 12 孔板 TAKARA RNAiso Plus（9109）；

2. PBS 冲洗一遍，每孔加 Trizol，用 qiang 头「井」字法划孔底，并且吹打数次，收集到 EP 管中后重新吹打；

3. 离心后取上清用黄 qiang 头，控制速度慢吸，并且整个过程中 qiang 头保持在液面以下 0.5 - 1 mm；

4. 异丙醇离心完之后，有可能出现沉淀，有可能不出现，和细胞量有关，并且有些沉淀并不明显，表现为很透明的薄膜状，需要仔细辨别；弃异丙醇，我的 Trizol 说明书里面可以残留少量异丙醇，如果离心完可以观察到沉淀，我会蓝 qiang 头慢吸--白 qiang 头吸干，如果沉淀不明显，可以残留少量异丙醇；

5. 乙醇洗涤，沉淀会变明显，但由于洗涤的离心转速并不高、时间并不长，所以在弃乙醇的过程中，要比较慢的吸，否则可能误弃沉淀（尤其是半透明的沉淀）；

6. 弃乙醇：蓝 qiang 头慢吸--白 qiang 头吸干；室温开盖 3 min，具体以沉淀变为半透明为准，一般 3 min 左右差不多；

7. 有些实验对 RNA 浓度有要求，可以 500ul trizol/孔，合 2 孔为一个 EP 管，溶解时加少量 DEPC 水（我一般用 20ul，若对浓度有要求会降到 10ul）。

8. OD 值结果：

太低---有机物污染：我的整个操作很注意无酶，但一段时间仍然有这个 bug，后来发现是乙醇没有弃干净，所以我的经验是要吸干；

太高---DNA 污染：加入氯仿离心后，上清液取的时候速度太快，后来控制了速度也改换了黄 qiang 头就好很多了。

具体方法：

12 孔板 1 ml Trizol/孔

1.PBS 冲洗一遍；

2. 加 Trizol 裂解，室温静置 10 min；

3. 200ul 氯仿，振荡器混匀，静置分层后 离心 12000 g 4° 15 min

4. 去上清，加 500ul 异丙醇，室温静置 15 min，离心 12000 g 4° 10 min；

5. 弃异丙醇，75% 乙醇（75% 无水乙醇+ 25% DEPC 水）洗涤，轻轻吹打使沉淀悬浮后离心，7500 g 4° 5 min；

6. 弃乙醇（弃干净），室温开盖 3 min；

7. DEPC 水溶解得 RNA。

作者：@卿亦清明 0704