我的奋斗史：realtime-PCR 达人养成记（上）

当我艰难摸索的时候，我就想：等我都学会了，我一定要写篇文章，把一个初学者最初的想法和觉得矛盾、困难、不知如何入手的方法、难点和最后解决的办法写出来。既可以帮助像我一样的人，又可以让自己有点小小的成就感。好了，现在开始吧。

仪器 ABI7000 是如何做溶解曲线的？

我们单位刚开始的时候只有一台仪器 ABI7000，其他人都是用 taqman 探针做的，而且只是对结果进行定性分析。

我用的是 SYBR green 染料，是需要做溶解曲线的。关于设置的问题就来了，设置好 PCR 的程序以后，在程序下方有一个框框。具体我忘了，把那个框框打上勾就好了, 溶解曲线的温度是不能高于 60 度的，所以我有部分产物解链温度太高了，出来的溶解曲线只能出来半侧峰或者没有峰。

后来单位又购进了一台 ROCHE 480 lightcycleR 能设置溶解曲线的反应程序，这个问题就解决了。

阈值的调整以及重复性的问题？

阈值一般设在最大荧光信号的 1/5 或是 R2 最大时的 CT 值为阈值标准，根据不同的仪器选择。关于重复的问题，通常相同试剂、相同模版、同一个反映条件 CT 不要相差一个循环以外，比如复孔。

扩增效率的问题

lightcycle 扩增效率在 1.9～2.05 之间认为结果是可以应用的，有可比性。其它仪器是 90-105%。

关于梯度稀释问题

模版 10 倍稀释后，每个梯度 CT 值相差要控制在 3.3～3.5 个循环之间。如果 CT 值超过 30 个循环以后，就不适宜做梯度稀释了。因为这个时候浓度太低，定量本来就不准，所以梯度稀释结果不能用作参考的。

标准曲线人人要有

通常，有些人做很多标本时，要用不同的 pcr 反应板，但又不能同时一次进行。这时每个反应板最好都做标准曲线，斜率相差小于 0.1，结果可认为具有可比性。且扩增斜率要在 -3.6 到 -3.1 之间结果最好。当然了，这个时候因为每个板都做标准曲线了，分析的时候既可以用 detadetaCT 法，也可以用双标准曲线法了。

如何进行结果分析

我想所有做过 realtime-PCR 的人都熟悉那个很复杂的公式吧。什么 sampl A、什么 sampl B、什么 target、什么 Reference 。我当时就在思考，在我实验当中，到底哪个参数充当 Reference 的角色？

偶尔在丁香园上看到一篇文献，具体我也忘了，大体就是说如果是讨论两组时间的表达量差异，Reference是可以不要的，指数直接是同一个标本的-（目标基因-管家基因的 ct）就可以了。

如何理解标本做复孔问题？

原来我一直都不理解标本做复孔的问题，就是不知道怎么做，我以为是一个标本，在不同的反应板里做 3 次，取平均结果，同一个实验室里也没人做过的，后来问同学，才知道，在这里谢谢她了。

过程如下：20ul 体系，比如说你要做 10 个标本，每个标本要做 3 个复孔，就先准备 1undefined3+大约 5 个标本的母液（含酶、realtimepcr 的试剂等，但不包括模板），然后准备 10 个 500ul 的 pcr 管，每个分装 60ul。然后在分装好的母液中加入 3ul 的模版，混匀后再分装 20ul 到 3 个 realtime 反应孔中，这样就说传说的 3 个复孔了，避免了不同批次、加样等等误差。

注：这里考虑浪费，所以母液分装时多准备了。且分装模板混合物时转速不要太大，基本上 1000 ~ 1500 几秒就够了，要不然酶会下沉，我通常是混匀两次离心两次再分装。

条件优化的那些事

关于 realtime-PCR 优化问题真是浪费我不少钱，现在我把我的秘密告诉你。

先跑普通 PCR 看看你的引物有没有问题，看看正常的产物能不能出来。一切正常的话就上 realtime-PCR 。

realtime-PCR 时，所有反应的 ct 值必须控制在 12～30 个循环之间，结果才有可比性。我的管家基因 ct 值已经到了 13-17 之间了，但是我目标基因已经在 30 个循环之外了，表达量很低。询问了 roche 的工程师，他说我的管家基因表达量太高了，最好换下别的管家基因，或是提高目标基因的表达量，我想他是对的。

关于控制非特异性扩增的问题，除了看溶解曲线之外，另外一个方法是我非常推崇的，我现在还很后悔我没有早早的用这个方法，以至于浪费了很多钱，那就是采用 realtime-PCR 产物去跑胶 2.5% 琼脂糖。我上样 10ul，好的反应，真是一点杂带也没有，不好的话杂带好多，呜呜呜，这个方法真是很灵敏的，根据结果乖乖的调整你的反应条件或者干脆重新选引物。不过我看 ABI7000 的仪器说明，好像说是，你要是用 PCR 产物跑胶的话不能做溶解曲线，不知道是不是这样，我没研究过。