如何更有效运用 CRISPR-Cas9 技术开展研究？
吉凯基因
我们知道 CRISPR 技术可以在基因组水平对目标基因进行激活上调、转录抑制以及缺失。那使用 CRISPR-Cas9 技术需要考虑哪些问题？今天在这里给出几点建议供大家参考。
一、 选择合适的基因功能研究技术
Activation，repression 或者 deletion 到底该选择哪个？
以 lncRNAs 为例，如果研究的 lncRNAs 在选择的细胞模型中是有表达的，那 CRISPR-del 和 CRISPRi 两种基因功能缺失 (LOF) 策略是不错的选择。但是通常情况下没有研究能够告知哪种技术对于 lncRNAs 的研究更加有效。CRISPRi 只需要构建 1 个 sgRNA，而 CRISPR-del 则需要构建至少两个 sgRNA。
而当研究的 lncRNAs 在选择的细胞模型中不表达时，CRISPRa 功能获得 (GOF) 策略就成为非常有效的方法。从治疗角度来看这个问题，功能缺失 (LOF) 策略优于功能获得功能获得 (GOF) 策略，原因是已经有很多 ASO 功能抑制药物，其原理也是功能缺失 (LOF)。理想情况下，具体实验应该使用多种不同技术来确保实验结果的敏感性和准确性。
二、文库选择与设计
到底是选择全基因组文库还是亚文库？这个与具体的实验以及要验证的功能有关。
那文库基因覆盖的范围又如何确定呢？最理想的情况是，选择的文库能覆盖细胞模型中表达的所有基因。但这点很难做到，特别是 lncRNAs。原因是 lncRNAs 的注释信息不够全面详细。
这时有两种选择方案：
一是选择已有的文库，但是可能与研究选择的细胞模型不能完美匹配；
二是选择定制新的文库。
定制文库设计的三个步骤：
1、候选基因的确定；
2、确定转录起始位点；
3、sgRNA 的设计，将脱靶效率降到最低水平。
三、细胞模型选择
细胞系的选择需要与研究的癌症疾病匹配，基因组数据完整全面比如 RNA-seq，CAGE 和组蛋白修饰数据。细胞模型的选择可以参考目前比较权威的两个数据库：ENCODE 和 Cancer Cell Atlas。
四、 数据分析
CRISPR 筛选技术的最后一步就是通过对比 Pheno+ 组和 Pheno- 组，从 NGS 数据中鉴定出命中基因。有多种数据统计分析算法可以选择：MAGeCK/ENCoRE、Bayesian analysis (BAGEL)、STARS，只是不同的统计算法对数据的要求不同。
五、其他考虑
表型分析：CRISPR 技术可以与目前已经建立的基于细胞的不同表型分析方法结合，从简单的增殖实验到复杂的耐药性、迁移和标志物基因表达实验。
实验数据：任何研究都必须由完整的实验记录和实验数据组成，在使用 CRISPR 进行研究时，关键参数必须受到监控和控制，以确保最终结果的准确性。要求保证整个实验数据的完整性，至少两次的生物学重复。
希望上述的几点建议能够对有兴趣使用或计划使用 CRISPR/Cas9 技术进行研究的朋友们带来帮助。
