基因转运用的 SIV 载体颗粒的生产

基因转运用的 SIV 载体颗粒的生产

材料

试刻

牛血清白蛋白（B SA 第 5 组分）

1 % 的 BSA 溶解在 PBS 中作为冰冻培养基，保存在 4°C。

用于磷酸钙转染的 Calphos 哺乳动物转染试剂盒

转染和转导细胞系

293T 细胞

T E 671 细 胞（人横纹肌肉瘤， ATCCCRL-8805)

sM AG I 短尾猿细胞

这些细胞应该允许 SIVmac251 复制，并且拥有一个稳定整合的由 SIV/HIV M 诱导的HIV-I LTR 驱动的 ZacZ 转录单元。 sMAGI 细胞生长培养基为 DMEM/10% FCS/潮霉素(50ug/ml)/G418 (200ug/ml)。

含 有 0. l l g / L 的维生素 B 6 钾盐和维生素 B 6 的 DM EM 培 养 基

在 DMEM 中加入 10% FCS、 100 ug/ml 链霉素 和 lOOp/ml 青霉素，保存在 4°C。

灭活的胎牛血清（FCS)

G418 (100 mg/ml 溶解在水中， Geneticin; Invitrogen)

用 0. 22 um 孔径滤膜过滤，保存在一 20°C。

戊二醛溶液（0.5% 溶解在 P B S 中，保存在 4°C )

溶解在 P B S 中的潮霉素 B (50m g/m l， 保存在 4° C ， Invitrogen)

核酸

慢病毒载体 DNA，用一个选择性的内部启动子编码慢自我失活载体，并编码
报道基因 GFP

在内部转录框中选择启动子应该要基于启动子在相关耙细胞中的特性。

包膜糖蛋白表达载体（如 VSV-G)

病毒结构蛋白（Gag-P o D 表达载体

多聚甲醛溶液（4 % ，溶解于 PBS，室温保存）

不含钙、镁和碳酸氢钠的无菌 PBS 溶液

聚凝胺储存液（海美溴铵； 8m g/m l 溶解在 H 2O 中； Sigma-Aldrich)

胰酶

胰酶-E D T A 溶解在不含钙和镁的无菌的 I X Hank 平衡液中

维尔烯 1 : 5000 (Invitrogen)

X-gal 缓冲液

43.5m m ol/L 脱氧胆酸钠（一水化合物； Sigma-Aldrich)

2 mmol/L MgCl2 • 6 H2O (Sigma-Aldrich)

5 mmol/L 铁 氰 化 钾（Sigma-AWrich)

5 mmol/L 高铁氰化钾（Sigma-Aldrich)

0.002% NP-40 (RocheDiagnostics)

溶 解 在 P B S 中。对 于 sM AGI 细胞，用 N aO H 调 节 p H 到 9. 0

X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-(3-1>半乳糖苷）（Euromedix)

配 成 60 X 储 存 液 ，用（DMF; Sigma-Aldrich) 稀 释 到 终 浓 度 为 40 mg/ml。保存在—20°C。在染色细胞之前，将 X-gal 添加到新鲜的 X-gal 缓冲液中。

设备

FACS Calibur 流式细 胞 仪（Becton Dickinson)

流 式 管（Becton Dickinson)

荧光显微镜

滤 膜（0.45um 孔 径）

反转录酶分析试剂盒（Roche Diagnostics)

标准的组织培养设备，包 括 100mm 印和六孔培养皿

超速离心管（26 ml， 25 mmX89 mm，聚异质同晶体， Beckman)

方法

生产，浓缩和保存 S IV 载体颗粒

1.转染前一天：铺约 2.4X 10⁶ 个 293T 细胞到直径 IOOmm 的组织培养皿中，保 持 12 ml/皿的终体积。

2.转染当天：将 8. Iug S IV 包装载体、 8. Ijug 转运载体和 2. 5u g 包膜表达载体用磷酸钙法转染。

3.转染第二天：培 养 约 15 h 后 ，将培养皿中的培养基轻轻去除，更 换 成 IOml 新鲜培养基。

4.转染第三天：培养约 36 h 后 ，收集病毒：低速离心培养基去除细胞残渣，用 〇.45um滤膜过滤。

过滤好的上清可以保存在一 80°C。

5.将上清转移到一个 26m l 的超速离心管中。用 70Ti Beckman 离心机在 4°C 用 110 OOOg(32 000r/min) 下离心 2 h 收集病毒颗粒。

6.去除上清，用 5 ml PB S 清洗管壁。将离心管倒置在滤纸上 5 min，让其干燥，然后擦干管壁。

7.加 人 1/100 最初的病毒上清的体积的冰冷的含有 1% B S A 的 PB S 重悬病毒颗粒，冰浴 2 h。

8.将病毒颗粒等份分到微型离心管中，保存到一 80。 〇或者是液氮中。
样品可以保存至少 6 个月而不影响病毒滴度。

转导分析

9.前一天：接 种 TE671 或者是 sMAGI 靶细胞到 6 孔板中，密度为 4 X 10⁵ 个细胞/孔 ，终体积为 2 ml/孔。

10.当天:先用 lmlDMEM/10% F C S 准备一系列载体稀释液，在 含有 6ug/m l 聚凝胺的条件下加入到细胞中。

11.在 37°C 孵育培养基至少 4 h。吸去含载体的培养基，更 换成 2m l 新鲜培养基。将细胞 在 37°C 条件下继续培养 72 h。

12.第 3 天 ：用胰酶消化细胞，用含 4 % 的多聚甲醛的 P B S 固 定 30 min，然后转移到流式管中。用流式细胞仪分析细胞。

分析时，转导效率通常由用 Im l 病毒上清转导 4 X I O ⁵ 靶细胞后 G F P 阳性细胞所占的百分比来决定。

感染滴度用转染单位 A nl 表 达 ，可以用下列公式进行计算：
Titer= (4X 10⁵/l 〇〇) Xd

式中， d 表 示 病 毒 上 清 的 稀 释 因 子 表 示 用 转 导 5 % 〜1 0 % 的 G F P 阳性细胞所需要的病毒上清来进行流式分析所测量出来的 G FP 阳性细胞的百分比。

感 染 复 数（moi) 是指感染的病毒颗粒与靶细胞的比例。

载体的安全测试：检测 PCR

13.前一天：接种 sMAGI 靶细胞到 6 孔板中，密度为 4X 10⁵个/孔，终体积为 2 ml/孔。

14.当天：用 S IV 载体颗粒对 sMAGI 细胞进行初次感染。lmlDMEM/10% F C S 准备一系列载体稀释液，在含有 6ug/m l 聚凝胺的条件下加入到细胞中。培 养 4 h 后，吸去含载体的培养基，更 换 成 2m l 新鲜培养基。将 细 胞 在 37°C 条件下继续培养 72 h。

15.第 3 天：用胰酶消化细胞。

a•检测 G F P 阳性细胞的百分比：将 1/3 的细胞用含 4 % 的多聚甲醛的 P B S 固定30 min，然后用流式细胞仪分析细胞。

b. 检测β-半乳糖苷酶的表达：将另一个 1/3 的细胞重新接种到一个 24 孔板中，每孔的体积为 lm l。当细胞长满后，用 Im l 含 0.5% 戊二醛的 P B S 固定 lOmin，然后 用 Iml PBS 洗一遍， 32°C 条件下用 X-gal 溶 液（pH 9. 0 ) 孵 育 2 h。

c.让最终的 PCR 扩散：将最后的 1/3 的细胞重新种到一个 6 孔板中，每孔的体积为 2 ml。培养细胞 10〜15d。

16.第 14 天：在第 2 次感染前一天，接种 sMAGI 靶细胞到 6?L 板中，密度为 4X 10⁵ 个/孔，终体积为 2 ml/孔。

17.第 15 天: 用初次感染靶细胞的上清（从 13〜18d 的感染培养基）来感染作为靶细胞 的 sMAGI 细胞。 37°C 用 Im l 上清感染靶细胞 4 h。更换成 2m l 正常的培养基。感染后将细胞在 37°C 条件下继续培养 48〜72 h。检测反转录酶和 G F P 以β-半乳糖苷酶的活性。

为了证明含 G FP 的 SIV 载体的运动的存在，展 示 SIV 储存液不含有 PCR 和 M 重组反转录病 毒 ，在所有的试验的感染后的 48〜72 h 中， G FP 和卩-半乳糖苷酶都不应该表达。另外 ，在初次和二次感染细胞的过程中的上清中，反转录酶应该保持失活。作为试验中的阳性对照 ，可以用野生型 SIVmac251 感 染 sMAGI 细 胞 ，然后检测这个时间段中重组反转录病毒经历复制和扩增以后的反转录酶的活性以及tat如基因的表达能力。