基因转运用的 HIV-2 载体颗粒的产生

基因转运用的 HIV-2 载体颗粒的产生

材料

试剂

CaCl2 (lm ol/L )

转化和转导细胞系： 293 T 细胞或者 293 F T 人胚肾细胞

生 成 H IV -2 载体颗粒的 DNA

HIV-2 载体 DNA

包 装 载 体（HIV-1、 HIV-2 或者 FIV)

包 膜 质 粒（VSV-G)

含 有 1 0 % 胎牛血清 FBS、氨基酸、抗生素、抗菌素混合物的 DMEM 培养
2X HBS

Ig HEPES 酸（Sigma-Aldrich H3375)

1.6 g NaCl

0.72 ml 0. 25mol/L Na2 HP04

Iml lm ol/L KCl

加 人 到 100ml 双 蒸 水 中 ，用 NaOH（5mol/L和1mol/L） 精 确 调 节 pH 到 7 . 1 2

含 有 2 % 多 聚 甲 醛 的 PBS

PBS

聚凝胺储存液（海美溴铵；8m g/m l 溶解在 P B S 中）

胰酶

设备

流式细胞仪

荧光显微镜

转头

4 5 T i 固定角转头（Beckman-Coulter)

45Ti 水 平 转 头（Beckman-Coulter)

标准的组织培养设备，包括直径 100 mm 的组织培养皿和 12 孔板

滤 器（0. 45um 孔径）

台式离心机

方法

HIV- 2 载 体 的 生 成（磷 酸 钙 法）

1.转染前一天，接 种 约 4.0x10⁶ 个 293 丁细胞或者 293 FT人胚肾细胞到直径 100mm的组织培养皿中，加 人 8 〜 IOml 含 1 0 % FBS、氨基酸、抗 生 素（如果需要）的DMEM 培养基，放 到 37° c ， 5 % 的 CO2 培养箱中培养过夜。

2.转染前 1〜2 h 更换培养基。

3 . 准备磷酸耗— D N A 共沉淀。将 15ug HIV- 2 载 体 DNA， IOug 包 装 载 体（HIV-1、HIV-2 或者 FIV) 和 5 哗 VSV-G 包膜质粒混合，然 后 加 人 374ul 无 菌 水 和 126ul 1mol/L CaCl2 到质粒混合物中。

4.把铺好的 293T 宿主细胞从培养箱拿到组织培养操作台。

5.在混合步骤 3 中的质粒混合物的同时，用 Im l 的移液管吸取500ul 2X H B S 逐滴加人到其中。用同样的移液管把磷酸钙-DNA 悬液逐滴加入到宿主细胞中。然后放回培养箱继续培养。

6.培 养 6〜8 h 后 ，将培养皿中的培养基轻轻去除，更换成 10 ml 新鲜培养基。

收集载体颗粒

7.转染 2d 以后，将培养基上清取出放到一个 50m l 的圆锥管中，更换新鲜培养基。将上清保存到 4°C 。

8.转染 3d 以后，再一次收集上清放入前一次收集的保存在 4°C 的样品中。如果细胞仍然活着，加入新鲜培养基， 24 h 以后再重复一次。

9.用台式离心机 2800r/miri 离心 15 min，去除不需要的细胞残渣。将上清转移到一个新的离心管中，用一个 30m l 的注射器和 0. 45JUII1 孔径的滤器过滤。将过滤好的上清分成 2m l 等份保存在一 80°C ，或者是像步骤 10〜1 2 中描述的那样浓缩！将过滤的上清分成等份保存，可以避免在测定滴度的时候将所有保存的载体冻融。

载体浓缩

10.将包含载体的过滤好的上清在 42 000 尽（在固定角转头 45 Ti中为 19 000r/min) 离心 2 h

1 1 . 去除上清，将离心管倒置到一个无菌纱布上，干 燥 2 min。

12.将管壁用无菌纱布擦干，然 后 用 20〜50 ul I X P B S 重悬，将所有的等份混合到一起 ，保存到一 80°C 到需要使用时为止。

载体可以保持一年，更长的保存时间将会降低载体的滴度。

病毒滴度测定

病毒滴度可以使用各种细胞类型来测定。本方寒假定使用 2 93T 细胞进行测定，并且以绿色荧光蛋白（GFP) 的表达作为标志。

13.在测定病毒滴度的前一天，将 293T 细胞以 2X 10⁴〜4 X 10⁴ 个/孔的密度接种到—个12 孔板中。放到 37°C , 5 % 的 CO2 培养箱中培养过夜。

14.滴度检测当天，先准备一系列 LOml 载 体 培 养 基 稀 释 液（5〜1 0 倍的间距），从IO²〜IO⁶ 颗粒/ml, 并且含有 8ug/m l 的 1， 5-二甲基-1， 5-二氮十一亚甲基聚甲溴化 物（Polybrene)。数 出 12 孔中每一个孔的细胞数，并重复 3 次 ，得出转导前的细胞数。将稀释好的载体加入到相关的孔中培养过夜。预期的滴度大约是 IO⁶转染单位/ml。

15.第二天，吸去培养基，更换成新鲜培养基。将细胞继续培养 2〜4d。

16.去除培养基，加 入 500ul 胰酶，室温下孵育 1〜2 min。去除胰酶，轻轻敲松细胞，用 Iml P B S 收集细胞。用含有 2 % 多聚甲醛的 P B S 固定样品和阴性对照。用流式细胞仪检测样品中 GFP 的表达。

17.用每孔中的病毒颗粒数和 G FP 表达的细胞百分数作图，测 定 当 5 〇 % 的细胞表达GFP 时所需要的稀释度，然后根据这个计算出载体保存液中的转染单位/mi 的数目。

另一个计算载体滴度的公式是

TU/ml= ( % G FP 阳性细胞/ioo) X (转导细胞数）X (稀释因子）
转导贴壁细胞

18.转导的前一天，接种贴壁细胞的密度在 6 孔板中约为 IXlO⁵ 个/孔或者是 4 X 10⁶ 个在 IOOmm 的培养皿中。放 到 37℃ ， 5% 的 C 〇 2 培养箱中培养过夜。

19.转导当天，去除培养基。加 人 2m l 不 含 F B S 的培养基、 lml 新鲜解冻的载体储存液、终浓度为 8ug/m l 的聚凝胺。放 到 37℃ ， 5 % 的 CO2 培养箱中培养 2 h。

20.吸去上清加人新鲜培养基到细胞中。放 到 37℃， 的 C 〇 2 培养箱中培养 2〜4d，用流式细胞仪或者是突光显微镜分析 GFP 的表达。

转导悬浮细胞

21.收集悬浮细胞，计数，用 I 5m I 的聚丙烯管在 5 〇〇 g 离 心 5m in 收 集 3 X 10⁶〜 5 X 10⁶个细胞。

2 2 . 用 I m l 不 含 F B S 的 培 养 基 悬 浮 细 胞 沉 淀 。

2 3 . 加 入 I m l 新 鲜 解 冻 的 载 体 储 存 液 ，轻 轻 混 合 。

2 4 . 加 入 聚 凝 胺 使 终 浓 度 为 8ug/ml。

25.将细胞/载体/聚凝胺混合物在 1〇〇〇 g 室温下离心 2 h。

26.吸去上清加入新鲜培养基重悬细胞。放 到 37 〇 c ， 5% 的CO2 培养箱中培养 2〜4d，用流式细胞仪分析或者是荧光显微镜 G FP 的表达。