实验讲堂开课：高通量测序是神马鬼？

生物学霸要开实验讲堂啦，每周给大家讲解一种实验技术，还会邀请技术大牛来答疑哦，看大家的喜欢程度啦。今天的主题是——高通量测序。

小师妹：霸霸，什么是高通量测序呀？

霸霸：高通量测序也叫下一代测序哦，你是不是想问那上一代测序是啥呢？嘿嘿，还真有，传统的叫桑格测序-Sanger Sequencing。

小师妹：这个我知道，以前基因都要送去测序的。那高通量测序是神马鬼呢？

霸霸：哈哈，小师妹就是聪明。高通量测序就是一次运行能产生很多的基因数据。

小师妹：原来这个意思，和以前筛菌一样，快了多了就叫高通量筛选。那不是人人都能做？

霸霸：错，那可是有技术含量的。目前主要的平台有罗氏的 454 测序仪、Illumina 的 Solexa 基因组分析仪、ABI 的 SOLiD 测序仪。

接下去就给大家具体介绍这三个测序仪都使用的是啥技术？有啥共同点呢？

454：焦磷酸测序

待测 DNA 样品被打断成 300-800 bp 的片段后，3' 和 5'端分别加上接头，这些接头会使 DNA 片段结合到微珠上。测序 PCR 反应就发生在固相的微珠上，并且整个 PCR 反应和相关的酶被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含 1 个 DNA 模板。扩增后，每个 DNA 分子可以得到富集，每个微珠只能形成一个克隆集落。

454 测序仪的测序通道体积非常狭小，只能容纳一个微珠。测序过程中，GS FLX 系统会将引物上 dNTP 的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号，就可以达到 DNA 测序的目的。454 可以提供中等的读长和适中的价格，适合 de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。

Solexa：可逆终止化学反应

DNA 片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的 ddNTP 原料被添加上去，不配对的 ddNTP 原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着 DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。

和焦磷酸测序不同，每次 DNA 只能延伸一个核苷酸。Solexa 的读长在 100-150bp 之间，适合小 RNA 鉴定、甲基化和表观遗传学研究。

ABI：种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序

测序之前，DNA 模板通过乳化 PCR 扩增，和 Roche 454 的基本相同，只是 Solid 的微珠更小，只有 1 μm。3' 端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是 8 个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品 DNA 就可以被探针标记。DNA 连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。

Solid 的读长只有 50-75 bp，精确度可达 Q40，适于基因组重测序和 SNP 检测。

小师妹：霸霸，你讲的这些好高深，不太懂呀。

霸霸：好吧，给你理理，其实他们的原理大同小异。

将目标 DNA 剪切为小片段

单个小片段 DNA 分子结合到固相表面

单分子独立扩增，每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号

这些仪器有有高分辨率的成像系统，能做好多的事，并且让测序的成本降下来了。以前人类要想测自己的基因序列，那是好多的钱，但是现在这个成本就低多了。未来能做的事会更多。

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参考文献

新一代高通量 RNA 测序数据的处理与分析

高通量测序技术及其应用

作者：霸霸

配图来源：网络