实验讲堂开课:高通量测序是神马鬼?
生物学霸
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生物学霸要开实验讲堂啦,每周给大家讲解一种实验技术,还会邀请技术大牛来答疑哦,看大家的喜欢程度啦。今天的主题是——高通量测序。
小师妹:霸霸,什么是高通量测序呀?
霸霸:高通量测序也叫下一代测序哦,你是不是想问那上一代测序是啥呢?嘿嘿,还真有,传统的叫桑格测序-Sanger Sequencing。
小师妹:这个我知道,以前基因都要送去测序的。那高通量测序是神马鬼呢?
霸霸:哈哈,小师妹就是聪明。高通量测序就是一次运行能产生很多的基因数据。
小师妹:原来这个意思,和以前筛菌一样,快了多了就叫高通量筛选。那不是人人都能做?
霸霸:错,那可是有技术含量的。目前主要的平台有罗氏的 454 测序仪、Illumina 的 Solexa 基因组分析仪、ABI 的 SOLiD 测序仪。
接下去就给大家具体介绍这三个测序仪都使用的是啥技术?有啥共同点呢?
454:焦磷酸测序
待测 DNA 样品被打断成 300-800 bp 的片段后,3' 和 5'端分别加上接头,这些接头会使 DNA 片段结合到微珠上。测序 PCR 反应就发生在固相的微珠上,并且整个 PCR 反应和相关的酶被油包水的液滴包裹,每个油滴系统只包含 1 个 DNA 模板。扩增后,每个 DNA 分子可以得到富集,每个微珠只能形成一个克隆集落。
454 测序仪的测序通道体积非常狭小,只能容纳一个微珠。测序过程中,GS FLX 系统会将引物上 dNTP 的聚合与荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号,就可以达到 DNA 测序的目的。454 可以提供中等的读长和适中的价格,适合 de novo 测序、转录组测序、宏基因组研究等。
Solexa:可逆终止化学反应
DNA 片段加上接头之后,可以随机的附着于玻璃表面(Flow cell),并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇,被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法,和模板配对的 ddNTP 原料被添加上去,不配对的 ddNTP 原料被洗去,成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着 DNA 3'端的阻断剂的去除,下一轮的延伸就可以进行。
和焦磷酸测序不同,每次 DNA 只能延伸一个核苷酸。Solexa 的读长在 100-150bp 之间,适合小 RNA 鉴定、甲基化和表观遗传学研究。
ABI:种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序
测序之前,DNA 模板通过乳化 PCR 扩增,和 Roche 454 的基本相同,只是 Solid 的微珠更小,只有 1 μm。3' 端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是 8 个碱基荧光探针混合物,根据序列的位置,样品 DNA 就可以被探针标记。DNA 连接酶优先连接和模板配对的探针,并引发该位点的荧光信号的产生。
Solid 的读长只有 50-75 bp,精确度可达 Q40,适于基因组重测序和 SNP 检测。
小师妹:霸霸,你讲的这些好高深,不太懂呀。
霸霸:好吧,给你理理,其实他们的原理大同小异。
将目标 DNA 剪切为小片段
单个小片段 DNA 分子结合到固相表面
单分子独立扩增,每次只复制一个碱基(A,C,T,G)并检测信号
这些仪器有有高分辨率的成像系统,能做好多的事,并且让测序的成本降下来了。以前人类要想测自己的基因序列,那是好多的钱,但是现在这个成本就低多了。未来能做的事会更多。
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参考文献
新一代高通量 RNA 测序数据的处理与分析
高通量测序技术及其应用
作者:霸霸
配图来源:网络