CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 293FT 细胞转染验证 and trouble shooting

前期记录

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 目标基因背景调查

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- sgRNA 及引物设计

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 构建 sgRNA+Cas9 载体

golden gate 构建好载体，酶切验证成功

293FT 细胞转染验证

1. sgRNA+pSpCas9 载体用 lipofectamine 3000 转染至 293FT 细胞（按照转染试剂的说明书走），确保转染效率> 70%；

2. 72 h 后收集细胞提取基因组 DNA（按照基因组 DNA 提取试剂盒的说明书操作）；

3. 使用事先设计好的引物进行 PCR 扩增，这里使用的酶是 NEB 公司的 Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照该酶的说明书严格操作；

4. 将目的条带切割下来并使用胶回收试剂盒回收 DNA 条带，一切按照胶回收试剂盒说明书进行操作；

5. 回收后的 DNA 样本，经 T7 Endonuclease I 酶解验证错配 DNA，部分结果如下：

T7 EI

验证成功，开始正式实验

时间飞逝，上次说提取质粒后验证，这部分就花了一天时间；加上打台风影响细胞复苏，耽误了 1 - 2 天，复苏细胞后隔一天立刻传代种板，第二天发现细胞稍微少了一点，又等了一天，转染后虽然是 72 h 应该收 sample，但细胞数目略少，可能提取不到足够的基因组 DNA，所以让细胞又长了一天，直到百分之 80 以上的融合度（因为我用的是 24 孔板）。基因组 DNA 提取之后立刻进行 Q5PCR，跑胶切胶回收，T7EI 酶切再跑胶，这个骚操作一天做不完，分了两天做，所以就一下子花了将近十天时间，嘤嘤嘤，这要放在其他组，可能都要被老板骂死了。

为啥不提前准备好细胞，为啥不计数种板，为啥为啥为啥为啥，事实上我自己也觉得不满意，但好在最终得到了想要的结果，在还不确定自己的操作是否足够风骚的时候，请务必要小心谨慎，毕竟每一步都有可能出问题。我在新手期曾遇到过的问题如下：

1. 转染效率没达到百分之 70，最后找到原因是因为转染试剂过期，加大量之后就搞定了；

2. 基因组 DNA 提取效率低，仅仅有几到十几 ng/μL，质量也很差。这里需要注意的是，293FT 细胞非常脆弱，一方面要保证足够的细胞量，另外一方面，由于该细胞贴壁不牢，可直接吹下收集去裂解，而不需要使用胰酶消化下来，再终止离心收集去裂解提取基因组 DNA。

3. Q5 PCR 可能会出现问题，一般情况下 Q5PCR 是很稳妥的实验，但是前天我有一套 sample 全部都没有出条带，一时半会不能找到原因在哪里，这种时候我会将引物丢弃，重新配置 PCR 体系，保留原条件的同时，增加 extension time，结果令人满意，不仅是原条件，新条件都出现了目的条带。说明我可能是在配样的过程中出现了问题。因此还是建议样本量大的时候还是要尽量耐心去 check 每一个步骤或者直接分开操作。

4. Q5PCR 说了，在不加错样的情况下，一般是没有难度的，但一般胶回收可能会出现问题，同样是浓度低。那么需要注意的就是，琼脂糖凝胶尽量配厚一点，不要让样本从上样孔里面溢出来，一点点都不能浪费，那么操作胶回收实验的时候也要尽量保证不浪费，尽可能保留多一些 DNA fragment，但最好的解决办法就是在 Q5PCR 步骤时要获取足够多的 PCR 产物。

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