如何获得高质量的免疫荧光图

在免疫荧光染色过程中单染和共染是常用的两种方式，除此之外我们还可能会用到远红外进行染色标记。

这相对于前两者实验操作上处理方法是一致的，唯独在样品处理上有所不同，而导致荧光定位标记的颜色增多，相对而言变得复杂。

免疫荧光技术主要是通过抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

那么接下来，我们重点来介绍免疫荧光操作方法以及注意事项。

操作步骤：

1. 首先，在常温下将组织切片用免疫组化笔进行画圈，接着加入 0.1M PB 约 50 微升左右，进行每次 20 分钟的漂洗，漂洗 2 次即可；

2. 接着，加入约 50 微升的 0.3％Triton ，一次 10 分钟漂洗 4 次；

3. 加入约 50 微升 3％的驴血清（用 0.3％Triton 进行配制而成），在常温下孵育 30 分钟进行封闭；

4. 加入约 50 微升用 0.03％Triton 稀释的一抗，然后进行 4℃ 孵育过夜即可；

5. 加入约 50 微升 PB 配制的 0.3％triton，在常温下进行漂洗 4 次，10 分钟一次；

6. 加入约 50 微升 PB 配制的 0.03％Triton 稀释的二抗，在常温下放置 1 小时；

7. 加入约 50 微升 0.1M PB 进行漂洗，总共漂洗 3 次，10 分钟一次；

8. 加入约 50 微升的 DAPI 工作液（1 比 10000），室温孵育 4 到 8 分钟左右即可；

9. 加入约 50 微升 0.1M PB，在常温下进行漂洗，总共漂洗 3 次，10 分钟一次；

10. 最后，取适量 pH8.5 的封闭液进行封片，晾干即可拍照。

注意事项：

1. 固定脱水之后要保证样品较为新鲜的情况下进行处理，不宜放置过久。存储于 -80℃ 的样品，取出后需进行烤片 30-60min，防止浮片。

2. 若所用抗体的特异性较弱，可在 0.1M PB 清洗之后用抗原修复液在常温下修复十分钟。

3. 血清封闭液的选择，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次 10 分钟。

4. 一抗的浓度不能只参考说明书要求，为找到适宜的荧光强度需在第一次使用时设置浓度梯度。一抗孵育需 4℃ 过夜，第二天可进行回收，回收后的抗体可重复使用 3 次左右。

5. 共染时务必注意种属源性。一抗的种属来源不同，二抗的种属来源需对应一抗的属性。

6. 封片时需注意无气泡，动作轻缓，同洗涤时一样，做到轻柔，防止最后一步出错导致前功尽弃。

7. 必须将存留于切片上的多余的 PBS 甩干，切片上 PBS 存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。

加入的抗体以一滴为佳，约 50ml，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡。

8. 在实验过程中不可干片，全程要在湿盒中进行，除最后一步封片。

其主要原因是防止非特异性染色（尤其是在做 BrdU 增殖染色时，要注意 37℃ 孵育一小时中不可干片，否则最后无法正常染色）。

共定位效果较好的图片：

图一

图二

图三

激光共聚焦显微镜拍摄时的注意事项：

1. 首先我们要熟悉激光共聚焦的使用方法，开机和关机顺序要注意，尤其是激光器的使用，务必要预热 10 到 15 分钟方可打开激光。

2. 在 smart set up 中选择 best signal，对应相应的激光波长选择相应的颜色（488-FITC，568-RHOD，647-White，后期也可在软件中进行修改）。

3. 拍摄过程中要注意选择的像素和拍摄速度，一般选择 102undefined1024，speed 为 5-7。

4. Pinhole 值不宜过大，在操作过程中可点击 1AU-Max，获得荧光强度适宜的图层。

5. 为拍摄出完美的荧光图，可通过调整 Gain 值改变荧光强度，再通过调整 Digital Offset 和 Digital Gain 来降低背景噪音以及调整荧光强度。（作者：不 2 兔，图片：不 2 兔，封面：丁香通）