NBT：单细胞测序技术新进展，Fei Chen 等开发新型单细胞 RNA 分子「时间戳」
背景介绍
转录组测序技术的快速发展，特别是单细胞转录组测序分析，使得研究人员能够更加深入探究复杂的生物学组织的详细分子特征。
目前，单细胞转录组已广泛应用于生物医学研究的多个层面，其在解析细胞异质性、鉴定新型细胞亚群层面具有独特的优势，特别是在珍贵样本或者少细胞样本情况下，其重要性更加明显。
自 2009 年汤富酬老师发表第一篇单细胞转录组测序文章以来，单细胞转录组测序相关研究如雨后春，呈指数增长趋势；另外，各种测序平台、测序方法也应运而生。同时，单细胞相关研究也是 CNS 等各大主刊的「宠儿」。要想发表高影响因子的文章，单细胞组学分析或许是其能否被接收的重要因素之一。
但是，由于测序是一种以破坏细胞为基础的检测技术，因此目前的这些方法只能提供细胞的瞬时状态，也就是说我们所获得的测序数据仅仅反映了细胞某个时态的特征，无法追溯细胞内相关分子的动态表达过程。
倘若能够根据测序信息获得 RNA 分子的动态表达信息，那么我们就可以更加深入地了解细胞的分化发育过程，明确在各个重要的发育节点上的调控机制；分析并鉴定出各基因分子之间的调控关系；寻找疾病发生发展过程中关键的调控因子等。
最新的研究通过对新合成的 RNA 进行代谢标记，以此为转录组测序技术增加时间维度的信息，还有研究通过计算未剪接转录本的比例来推断细胞的分化方向。尽管如此，这些方法也只能提供基因表达水平的衍生物或单个时间点的表达信息，并未实现追踪细胞中 RNA 转录状态的目的。相对而言，很少有手段研究细胞状态是如何在数小时的时间尺度上由复杂的转录动力学引起的。
为了克服这些挑战，2020 年 10 月 19 日，来自麻省理工学院的研究团队在 Nature Biotechnology 在线发表题为 RNA timestamps identify the age of single molecules in RNA sequencing 文章，该团队通过引入 RNA「时间标签」的方法，将时间信息合并到转录组测序技术的标准流程中。
主要内容
「时间标签」的生物学原理
首先，在生物学原理层面，该研究通过 A-to-I RNA 编辑事件的逐渐积累来报告 RNA 的「年龄」，即记录该 RNA 被转录后的时间信息。A-to-I RNA 编辑是由作用于 RNA 2 催化区域的人类腺苷脱氨酶 (Adenosine Deaminase Acting on RNA 2 catalytic domain, ADAR2cd) 引起的，该催化结构域已被证明可以通过与外源性 RNA 结合结构域融合而靶向于特定的 RNA。该区域的编辑可随后在时间标签的高通量测序中被识别为 A-to-G 突变。通过计算这种突变的频率，就可以推算出 RNA 被转录后的时间。
为了验证上述设计的准确性，研究人员将表达 ADAR 变体的 HEK293T 细胞和带有时间印记的 RNA 在四环素响应元件 (Tetracycline Response Element , TRE) 的控制下，在含有强力霉素的培养基中孵育 1 小时，并设计好的「时间标签」被放置在编码荧光蛋白的信使 RNA 的 3' 未翻译区。
随后他们加入了一种 RNA 转录抑制剂 — 放线菌素 D (Actinomycin D)，然后每隔一段时间就将细胞裂解后进行转录组测序，这样每次测序都会提供已知「年龄」的 RNA 群体，如下图 d 所示，「时间标签」会随着时间的推移被越来越多地编辑。
另外，在任何给定的时间点上，每个「时间标签」的平均编辑次数在多次实验之间具有很高的可重复性（下图 e）。
同时，研究人员发现，利用每个「时间标签」编辑次数的经验分布，完全可以从「时间标签」的编辑总数来估计一个 mRNA 转录本的「年龄」。随后，他们将从这些单小时诱导实验中获得的每个 RNA 编辑量的分布称为「单小时编辑分布」。细胞通常会包含一个给定的 RNA 转录本的许多副本，因此可以通过分析由启动子产生的「时间标签」RNA 的集合来推断一个特定启动子的潜在转录动力。
基于 RNA 编辑事件的算法可推测 RNA「年龄」
为了验证上述观点，他们开发了一个算法，能够在没有任何假设的情况下，推断出最符合某个特定的转录程序的「时间标签」。该算法是通过使用梯度下降法来确定单个小时编辑分布的凸面组合来推断转录程序。同时，基于多个 RNA 的「时间标签」进行估计将比基于单个 RNA 的「时间标签」估计更准确，这也是符合常理的。
「时间标签」技术可成功与单细胞转录组测序相结合
利用较少的 RNA「时间标签」会影响上述算法的性能，因此研究人员对它是否可以应用于确定单个细胞中转录事件的时间进行了探索。前期的细胞处理与上述的实验策略相同，只是在进行测序之前，研究人员先将单个细胞分选到 96 孔板的孔中，然后进行单细胞转录组测序，通过对编辑频率直方图的分析得出了每个细胞的平均诱导时间，发现它们的分布和上述频率直方图的分布是相似的。另外，基于这些时间估计，研究人员能够根据转录事件的时间对细胞进行排序，准确率高达 86%。
当前，基于液滴的条形码技术的单细胞转录组测序非常火热，由于其高通量的优势，使得科学家们能够详细解析各种组织或细胞的图谱。那么本研究中的「时间标签」是否可以与这种单细胞转录组测序技术（比如 10X）相结合呢？
为此，研究人员开发了一个分子生物学工作流程，能够从单细胞条形码全转录组扩增产物中靶向扩增「时间标签」。这使得「时间标签」和细胞条形码都可以通过 Illumina 双端测序检测到。在后续的验证实验中，这种添加「时间标签」的测序质量与相同条件下的批量测序相似。另外，在数据分析层面，通过对 659 个拥有高质量测序数据的细胞进行聚类分析，发现 659 个细胞中的 494 个（约 75%）被分配到正确的诱导条件，这些结果表明，「时间标签」可以与高通量的基于单细胞液滴的方法结合。
综上所述，该研究借助作用于 RNA 的腺苷脱氨酶的连续酶活性可以直接推断单个 RNA 的「年龄」这一原理，通过对编辑事件的统计来揭示细胞中转录动力学，并最终与高通量的单细胞转录组技术相结合，能够将时间信息与转录组信息相结合，具有广阔的应用前景。
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