献给初学者：WB 如何 1 分钟蛋白定量

在开始 WB 之前的蛋白定量耗费时间有点长，如果用 BCA 法的话光孵育就需要半个小时，整个过程耗时接近 1 小时。因此为了配合快速 WB，我们同样需要一个快速蛋白定量的方法。因此今天我们来聊聊如何 1 分钟测出蛋白浓度。

蛋白定量法

开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法： BCA，Bradford，双缩脲法（Biuret 法），Folin 法（Lowry 法）和紫外分光光度计法。

BCA 法的原理是在碱性条件下，氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物，测定 562 nm 的 OD 值，所以如果样本里有还原剂（比如 DTT）的话就会对 BCA 的结果产生干扰。

Bradford 法（考马斯亮蓝法）是在酸性条件下，加入考马斯亮蓝 G250 与蛋白质（主要是碱性或芳香族氨基酸）结合为蓝色化合物，吸光度值从 465nm 变成 595 nm，最后测定 595 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度。

双缩脲法或 Folin 法由于检测灵敏度不够高，早已被 BCA 或 Bradford 法所代替。

而紫外分光光度计法是利用氨基酸在 280 nm 处有吸收峰来定量，由于不同氨基酸吸收峰值略有不同，故在蛋白质成分单一的情况下使用佳，比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。

每个实验室都有各自的传统，在方法选择上青菜萝卜各有所爱，但绝大部分实验室要么用 BCA 要么用 Bradford 法进行蛋白定量。

下图简单总结了一下 BCA 和 Bradford 法各自的优缺点。

快速测蛋白法

显然，要想加快速度最好是选用 Bradford 法了。但是，Bradford 也存在一些问题，比如标准曲线线性相关性不佳，容易受 Triton，SDS 等去垢剂的影响等等。

好在我们都是站在前人的肩膀上，前人早已开发出去垢剂兼容型的 Bradford 试剂，性能优于常规 Bradford 法，比 BCA 法更快更方便。今天我们讨论的方法就是基于去垢剂兼容型的 Bradford 试剂来快速蛋白定量。不知道上哪里买的同学可以在丁香通上找找。

下图就是用 Bradford 法测出的标准曲线。虽然线性拟合不佳（R = 0.9667），但是二项式吻合度却非常高（R = 0.9994），可以说非常完美了。

下图展示了如何在 excel 中制作二项式标准曲线。

到此为止，前面我们担心的几个问题就已经全部解决了。第一，担心 Triton 或 SDS 的影响，我们用去垢剂兼容性的 Bradford 试剂即可。第二，担心标准曲线不佳，我们用二项式来拟合即可。

下面我们继续利用 excel 的自动化功能进一步提升计算速度。首先，初中的时候大家就学过，解二项式的公式是：

这条曲线是一条开口向下的抛物线，所以取 x 轴上的较小的值就是我们所要的浓度值。为了简单易用，我们可以先命名几个单元格为 background，a，b，c，从酶标仪读取 OD 值之后填入 background，复制标准曲线的光密度值，填入 excel 给出的方程中的 a，b，c 之后，excel 就能自动减去背景计算出浓度了。

整个过程熟练的话 1 分钟足矣，首次操作的同学 2 分钟也就足够了。俗话说好马配好鞍，快速 WB 需得配合快速蛋白定量方能有一气呵成、唯快不破的痛快淋漓。但是，使用这种方法需要注意的几个问题：

注意要点

1. 蛋白浓度不能太高，如果超过了标准曲线的范围（比如 OD>2），那就测量不准了。不仅是本方法，所有基于浓度标准曲线的方法都是如此，比如 ELISA。当然也不能太低了。

2. 大约 10 年前就有文献报道测量双波长，即 A595 和 A450 的比值能够获得良好的线性关系并提高灵敏度，这种方法我试过了，在 0.125-1.5 mg/ml 的范围内准确性不如二项式曲线拟合高。

3. 另外，标准品有可能发生降解导致浓度不准确，建议每次测量时加入一个已知浓度的样本作为校验。我每次都会加入一个 0.1-0.5 mg/ml 的 BSA 标准品，校验一下曲线是否准确。

4. 加入标准品的时候枪头一定不能有残留，否则容易引起较大误差，建议初学者刚开始时做 2 到 3 个标准品复孔。

5. Bradford 法加完样之后需立刻马上测量，OD 值能稳定保持 10 分钟左右，如果不能马上测量，建议换用 BCA 法。

6. 终极大招：如果你已经是老司机了，还有个方法不用测蛋白浓度，只要在显微镜下估测各组细胞密度差不多，直接提蛋白变性上样跑 WB 即可。但老司机也有翻车的时候，请慎用。

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