献给初学者：WB 操作步骤详解（上）
&丁香园
我做 western 的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份 western blot 操作步骤，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献。
我按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的 western 条带了，所以相信你也行。
背景
蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学 George Stark。Neal Burnette 于 1981 年所著的 Analytical Biochemistry 中首次被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家，但印迹的对象是 DNA 链，他把这种技术称为 Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对 RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为 Northern 和 Western，与这两个技术的发明人没有关系了。
一、蛋白质的样品制备
由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：
在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
样品建议分装成合适的量（比如分装出 20 ul 检测蛋白质定量用），然后于 -20℃ 或 -80℃ 中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。
二、蛋白质定量
如果要定量的话，一般选择 BCA 或者 Bradford 方法，BCA 要求检测波长为 562 nm，Bradford 为 595 nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马 G250 混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含 50~100 ug 蛋白的溶液体积即为上样量（一般 8 cm 宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为 150 ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。
网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。
上样总体积一般不超过 15 ul，加样孔的最大限度可加 20 ul 样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮 3~5 min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪 95° 加热 5 min，效果佳，操作方便。之后样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存，也可在 -20℃ 冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。
三、SDS-PAGE 电泳
1. 清洗玻璃板
蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。
2. 灌胶与上样
① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。
② 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入 TEMED，之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。
灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加 1 cm）。
③ 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定，通常在 30 min 左右，AP 不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不会超过 1 h，若超过 1 h 甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。
由于 TEMED 催化 APS 释放相关化学基团，再由 APS 释放的基团催化 Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 不新鲜的话加再多的 TEMED 效果也不佳，这就是为什么推荐 APS 每周新鲜配置的原因。
④ 按说明书配积层胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤ 趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95~100° 加热 5 min，若有沉淀可用稍低温度，比如 45~55° 加热 1 h 达到变性的目的。我一般习惯分装 20 ul 到 PCR 管里，先和 loading buffer 混合好，临用前用 PCR 仪加热 95 °C 5 min，效果不错。
⑥ 胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的 MV-III 型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。加样前可用 5 ml 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。
目前我们做的 mini 胶上有 10 个上样孔，一般在第一个孔加入 marker（我用的是 Fermentas 预染 marker），其余 9 个孔加入样品，也可在头尾孔内加入 marker，中间 8 个孔加样品。加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用 10 ul 的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。
3. 电泳
电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在《分子克隆》上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统 pH 的不连续性。
请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。
今天就讲到这儿，欲知后事如何，且听下回分解。
