实验时间 | WB 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）

Western Blot 实验原理

WB 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western Blot 分类

根据显色方法主要有以下几种：

1. 放射自显影

2. 底物化学发光 ECL

3. 底物荧光 ECF

4. 底物 DAB 呈色

现在常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

实验常见的问题指南

A. 对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【阅读原文】查看。

B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？

解答：一般地 undefined 106 就足够了。

D. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?

解答：能，没有问题，我们做过。

E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？

F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。

U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL + plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。