小鼠卵巢组织切片 HE 染色

对卵巢的组织学和病理学研究中，常常需要借助染色来观察组织切片中卵泡的形态结构，识别各种发育阶段的卵泡。HE 染色，即苏木精-伊红染色，是小鼠卵巢组织石蜡切片常用的染色方法。

HE 染色主要使用苏木精和伊红这两种染液，其中苏木精碱性染液为蓝色，可以将组织的酸性结构染成蓝紫色（细胞核呈现蓝色；软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝；粘液呈灰蓝）；伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电荷的阴离子，易于蛋白质氨基中的正电荷结合使细胞浆染色。

细胞浆、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色。

小鼠、固定液、酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡

苏木精染液、伊红酒精溶液、盐酸酒精溶液

甘油蛋白粘片剂、中性树胶

石蜡包埋机、切片机、恒温箱、蜡杯

酒精灯、解剖剪、培养皿、镊子、单面刀片

染色缸、盖玻片、载玻片、玻片盘、显微镜

温度计、水浴锅

一、制作卵巢石蜡切片

1、取材

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉，颈椎脱臼法处死小鼠，取出双侧卵巢。取下所需组织，切成一小块 3~4 mm 厚。

2、固定、洗涤、脱水

（1）将切好的卵巢组织用生理盐水洗一下，使用中性福尔马林固定液固定 30~50 min。后用流水冲洗 3 次，每次 5 min。

（2）卵巢组织依次经 70%、80%、90% 乙醇溶液脱水，各 30 min。

（3）再放入 95%、100% 乙醇溶液各 2 次，每次 20 min。

3、透明、透蜡

（1）使用纯酒精、二甲苯等量混合液处理组织 15 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min 至透明。

（2）放入二甲苯和石蜡等量混合液处理 15 min，再放入石蜡Ⅰ、Ⅱ透蜡各 50~60 min。透蜡在恒温箱内进行，箱内温度保持在 55~60 ℃ 左右。

4、包埋

（1）用镊子夹取蜡模在酒精灯上稍加热，并倒入少许从温箱中取出的纯石蜡。

（2）再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐，再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。

5、切片、展片、贴片

（1）将包埋好的石蜡块固定在切片机上，调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为 4~6 μm。

（2）切下的组织薄片要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放 45 ℃ 恒温箱中烘干。

二、HE 染色

1、脱蜡、复水

（1）保持水浴锅温度为 60 ℃，将切片放入干燥的染色缸内，放入水浴锅中，30 min 至蜡熔化。

（2）石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各 5 min，然后放入 100%、95%、90%、80%、70% 各级酒精溶液中各 3~5 min，再放入蒸馏水中 3 min，以便染料可以进入组织。

2、染色、脱水

（1）切片放入苏木精中染色约 10~30 min，用流水冲洗约 15 min，使切片颜色变蓝。

（2）将切片放入 1% 盐酸乙醇液中褪色，几秒后见切片变红、颜色较浅即可，后将切片再放入流水中使其恢复蓝色。 

（3）切片放入 50%、70%、80% 乙醇中各 3~5 min，用 0.5% 伊红乙醇液对比染色 1~3 min。

（4）将切片放入 95% 乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中 3~5 min，吸干后将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3~5 min。

3、观察

在镜下可见卵巢呈扁椭圆形，表面为单层扁平上皮细胞或单层立方上皮，卵巢实质分为皮质和髓质。可见上皮，原始卵泡和生长卵泡。卵巢组织中各发育阶段卵泡及卵巢基质的形态结构清晰可见, 细胞核呈蓝紫色, 细胞质及间质成分呈浅红色, 卵泡中卵母细胞、卵泡细胞、透明带均清晰可见。

1. 取材注意事项

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

（3）切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以 5 mm x 5 mm x 2 mm 或 10 mm x 10 mm x 2 mm 为宜。

2. 固定注意事项

（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的 20~30 倍，有些水分多的材料，中间应更换 1~2 次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 脱水注意事项

（1）脱水原理：乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

（2）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

（3）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

（4）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（5）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（6）如需过夜，应停留在 70% 酒精中。

（7）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。

4. 透明注意事项

（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

（3）在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明，否则切片难以镜检。

（4）二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。

5. 透蜡注意事项

（1）透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。

（2）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度。

（3）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低。

（4）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

（5）注意温度不要过高，以免组织发脆。

6. 染色水洗注意事项

（1）染色原理：伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。

（2）染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

（3）注意流水不能过大，以防切片脱落。

（4）如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。