🔥 NLRP3 炎症小体的激活及检测

核苷酸结合寡聚化结构域样受体含 pyrin 结构域蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain-containing 3, NLRP3）炎症小体是近年来研究较多的一类多蛋白复合体，通过调控 caspase-1 活化，诱导炎症因子 IL-1β 和 TNF-α 的成熟和分泌，促进炎症和细胞焦亡（pyroptosis），参与多种疾病发生。

细胞外三磷酸腺苷（ATP）门控离子的快速开放可导致胞内 K⁺ 的外排，进而诱导 NLRP3 的激活。脂多糖（LPS）等常见的内毒素，可通过细胞信号转导激活胞内多种细胞因子和炎性介质的合成与释放，引起一系列反应，利用 ATP 和 LPS 等处理可检测到 NLRP3 炎症小体的活化情况。

疾病模型的建立，药物筛选平台。

细胞培养箱、酶标仪、激光共聚焦显微镜、小鼠巨噬细胞（RAW264.7）、LPS、ATP、DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.25% 胰酶-EDTA 溶液、IL-1β 和 TNF-α 的 Elisa 检测试剂盒和碘化丙啶（PI）染色剂。

（1）细胞处理：RAW264.7 接种于 6 孔板，培养至 85% 后，将细胞随机分成对照组、LPS 处理组、LPS + ATP 共同处理组。对照组，PBS 洗涤一次，更换培养液，继续培养 6 h；LPS 处理组，PBS 洗涤一次，更换成含有 500 ng/mL LPS 培养液，作用 6 h；LPS 和 ATP 共同处理组，PBS 洗涤一次，更换成含有 500 ng/mL LPS 培养液，作用 5.5 h 后，不更换培养液，继续加入 2 mM ATP 刺激 30 min。处理结束后，收集细胞上清液进行 ELISA 检测。 

（2）ELISA 检测 IL-1β 和 TNF-α 的表达：严格按照 Elisa 试剂盒说明书对炎症因子 IL-1β 和 TNF-α 的含量进行检测，抗体包被使用平底半区透明 96 孔板，使用酶标仪于 450 nm 处进行样品吸光度检测。

（3）PI 染色检测细胞焦亡：细胞处理方法与步骤 1 中方法一致，处理完毕后，配制 40 μg/mL 的 PI 染色剂处理细胞，室温避光孵育 20 min 后，去除染色剂，PBS 洗两次，激光共聚焦显微镜下观察细胞死亡情况。

（4）数据处理：通过 SPSS18.0 软件对得到的数据进行分析。步骤 2 模型成立依据，对照组中不含 IL-1β 和 TNF-α；LPS 处理组中不含 IL-1β，但 TNF-α 含量随 LPS 刺激增多，较对照组变化明显；LPS + ATP 共同处理组，IL-1β 和 TNF-α 含量都增加，较对照组变化明显。步骤 3 成立依据，激光共聚焦显微镜于 535 nm 光激发下可检测到死细胞着红色。

1、PBS 洗涤细胞以及加入染色剂操作需轻，避免细胞吹起影响实验结果。

2、PI 染色液现用现配，注意避光操作，以防止荧光淬灭。