流式检测巨噬细胞吞噬作用

流式细胞术是对悬液中单细胞或生物粒子进行定量分析和分选的技术，具有速度快、精度高、准确性好的优点，广泛应用于细胞计数、细胞分选、分子表型分析、蛋白质工程等研究。

激活的巨噬细胞具有吞噬表面带有阳性可调理基团荧光微球的功能，将含有巨噬细胞的腹腔液与处理过的荧光微球孵育一定时间后，去除多余未被吞噬的微球，收集巨噬细胞，用流式细胞仪检测荧光情况，计数吞噬荧光微球的巨噬细胞，计算吞噬百分率和吞噬指数。

小牛血清，培养基，小鼠，1~2 μm 绿色荧光微球，1% BSA，PBS，载玻片或培养皿，6 孔板，解剖器械，移液枪或吸管，70 μm 过滤器，无菌注射器，培养箱，流式细胞仪（具备 Ex488nm/Em525 激光器）

1、荧光微球预处理：

取荧光微球与 1% BSA 以 1 : 100 体积比混匀，37 ℃ 孵育 30 min，超声处理 5 min 后，加入 6 孔板种，微球浓度为每孔 1 × 10⁷。

2、巨噬细胞获取：

1）实验当天用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射 5% 小牛血清的 Hank's 液 3 ml/只，轻轻按揉腹部 20 次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，移液枪或吸管吸取腹腔洗液；

2）用 70 μm 过滤器过滤至试管内，调整巨噬细胞数为 40~60 万个/ml。

3、荧光微球与巨噬细胞孵育：

1）用移液枪吸取 1 ml 巨噬细胞液于 6 孔培养板中，37 ℃ 细胞培养箱避光孵育 2 h；

2）孵育结束后弃上清 ( 含未贴壁细胞和多余荧光微球 )，用 1 ml PBS 缓冲液轻轻洗涤 2 次，去上清后再加入 4 ℃ PBS 缓冲液 0.3 ml，用细胞刮刮下贴壁的巨噬细胞，收集细胞悬液，轻轻吹打均匀后经 70 μm 滤膜过滤后上机分析。

4、计算巨噬细胞吞噬率：

通常用吞噬百分率和吞噬指数来反映巨噬细胞的吞噬能力。

吞噬百分率（%）=  吞噬荧光微球的巨噬细胞数 / 计数的巨噬细胞数 × 100 

吞噬指数 = 被吞噬的荧光微球总数 / 计数的巨噬细胞数

1. 低粒子率可能的原因是每毫升的细胞数量太少：制备 1 × 10⁶ 个细胞/ml，确保细胞充分混合（操作要轻）。

2. 高粒子率的可能原因是细胞数量过多：将细胞稀释成 1 × 10⁵ 至 1 × 10⁶ 个细胞/ml 样品。

3、为了防止出现细胞聚集，阻塞管道：染色前轻轻吹打几次确保形成同源单细胞悬液，运行之前再次混匀，在极端的情况下，可筛选或过滤细胞以去除团块（30 μm 的尼龙网）。