🔥 污染物致突变性检测：Ames 试验

微生物艾姆斯测试全称污染物致突变性检测，是一种简单，快速和强大的细菌测定，由鼠伤寒沙门氏菌/大肠杆菌的不同菌株和应用组成，用于确定诱变潜力。

Ames 试验利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株，该缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌诱导回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。

评估各种环境致癌物和毒素的致突变性，广泛应用于致癌物的筛选。

0.5 mM 组氨酸/生物素溶液、营养肉汤、琼脂、2-氨基蒽、丝裂霉素

叠氮化钠、2-硝基氟、磷酸钠缓冲液、大鼠肝 S9 混合液、氨苄青霉素

葡萄糖、组氨酸、色氨酸、生物素、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸钠·2H₂O

K2HPO4 ·3H2O、KH2PO4、（NH4）2SO₄

烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐（NADP）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-P）

KCl、MgCl₂ 等。

（1）细菌冻融液与营养肉汤混合后置于水浴摇床在 37 ℃、120 r/min 条件下扩增 10 h，扩增后使用酶标仪对光密度进行检测，估算活菌浓度达到 1×10⁹ 个/mL 后用于试验；

（2）为每个实验准备新鲜的诱变剂（见配方）。

阴性对照：蒸压蒸馏水

没有 S9 代谢激活的 TA 98、TA 100 和TA 102 阳性对照（S9 混合物）：叠氮化钠（1 μg/ml）、2-硝基氟（1 μg/ml）和丝裂霉素（0.125 μg/ml）

对于具有 S9 代谢激活的 TA 98、TA 100 和 TA 102（S9 混合物）：2-氨基蒽（2 μg/ml）；

（3）最小葡萄糖琼脂（MGA）平板的制备：琼脂 7.5 g、蒸馏水 465 ml、50x VB 盐 10 ml、40% 葡萄糖 25 ml、在 465 ml 蒸馏水中加入琼脂，并在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。冷却后，轻轻加入盐和葡萄糖。将最小葡萄糖琼脂平板的培养基混合，并将 25ml 倒入每个培养皿中；

（4）在实验前标记所有最小葡萄糖琼脂平板和 Eppendorf 试管；

（5）在 2 ml 无菌 Eppendorf 试管中，分别加入以下物质：

a. 0.1 ml 新鲜培养的沙门氏菌菌株

b. 0.2 ml His/Bio 溶液

c. 0.5 ml 磷酸钠缓冲液（不存在S9混合物）或 0.5 ml S9（存在 S9 混合液）

d. 0.1 ml 试样或 0.1 ml 阳性或阴性对照

e. 用高压灭菌的蒸馏水补充至 1 毫升。

（6） 将 Eppendorf 管的内容物混合，倒入培养皿中，并使用 L 形涂布器在 MGA 板的表面上涂布。用无菌铝箔覆盖培养皿，以保护测试样品免受光反应物质的影响。

（7）在 37 °C 下孵育 48 小时后，出现自发回复体菌落，肉眼可见。试验重复 3 次。

（8）还原物在培养基的表面和背景上形成了营养缺陷型细菌的均匀菌落。

（9）记录受试物各剂量组的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。

受试物经上述三个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加 S9 或未加 S9 条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经三个试验菌株检测后，无论加 S9 和未加 S9 均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。

1. 由于鼠伤寒沙门氏菌是一种致病细菌，因此每次都采取预防措施并应用标准的生物安全准则；

2.  化学品和菌株的处理应在生物安全柜中进行。在使用前后，必须使用 75% 乙醇对机柜进行消毒，并暴露在 15 分钟的紫外线下；

3.  在丢弃之前，所有受污染的材料（例如，试管、移液器和移液器吸头、防护服和手套）都应正确高压灭菌。

1.菌落分布不均匀，集中偏向一侧。

答：倒培养基时平皿未水平放置；

2.如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性。 

答：将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上，观察比较细菌的生长情况。如果经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中， 而经阳性对照物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上，则说明经受试物处理的菌株没有发生突变，试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。

参考来源：Vijay, U., Gupta, S., Mathur, P., Suravajhala, P. and Bhatnagar, P. Microbial Mutagenicity Assay: Ames Test. Bio-protocol, 2018,8（6）： e2763.