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🔥 污染物致突变性检测:Ames 试验

相关实验:致突变实验

别名:微生物诱变分析

最新修订时间:

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合作专家 | 江佳红硕士

生物物理学 大连海事大学

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审核专家 | 聂壹峰博士

纳米生物医学 中国科学院大学

原理

微生物艾姆斯测试全称污染物致突变性检测,是一种简单,快速和强大的细菌测定,由鼠伤寒沙门氏菌/大肠杆菌的不同菌株和应用组成,用于确定诱变潜力。

Ames 试验利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株,该缺陷型菌株不能合成组氨酸,故在缺乏组氨酸的培养基上,仅少数自发回复突变的细菌生长;假如有致突变物存在,则营养缺陷型的细菌诱导回复突变成原养型,因而能生长形成菌落,据此判断受试物是否为致突变物。

用途

评估各种环境致癌物和毒素的致突变性,广泛应用于致癌物的筛选。

材料与仪器

0.5 mM 组氨酸/生物素溶液、营养肉汤、琼脂、2-氨基蒽、丝裂霉素

叠氮化钠、2-硝基氟、磷酸钠缓冲液、大鼠肝 S9 混合液、氨苄青霉素

葡萄糖、组氨酸、色氨酸、生物素、MgSO4·7H2O、柠檬酸钠·2H2O

K2HPO4 ·3H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4

烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐(NADP)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)

KCl、MgCl2 等。

步骤

(1)细菌冻融液与营养肉汤混合后置于水浴摇床在 37 ℃、120 r/min 条件下扩增 10 h,扩增后使用酶标仪对光密度进行检测,估算活菌浓度达到 1×109 个/mL 后用于试验;

(2)为每个实验准备新鲜的诱变剂(见配方)。

阴性对照:蒸压蒸馏水

没有 S9 代谢激活的 TA 98、TA 100 和TA 102 阳性对照(S9 混合物):叠氮化钠(1 μg/ml)、2-硝基氟(1 μg/ml)和丝裂霉素(0.125 μg/ml)

对于具有 S9 代谢激活的 TA 98、TA 100 和 TA 102(S9 混合物):2-氨基蒽(2 μg/ml);

(3)最小葡萄糖琼脂(MGA)平板的制备:琼脂 7.5 g、蒸馏水 465 ml、50x VB 盐 10 ml、40% 葡萄糖 25 ml、在 465 ml 蒸馏水中加入琼脂,并在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。冷却后,轻轻加入盐和葡萄糖。将最小葡萄糖琼脂平板的培养基混合,并将 25ml 倒入每个培养皿中;

(4)在实验前标记所有最小葡萄糖琼脂平板和 Eppendorf 试管;

(5)在 2 ml 无菌 Eppendorf 试管中,分别加入以下物质:

a. 0.1 ml 新鲜培养的沙门氏菌菌株

b. 0.2 ml His/Bio 溶液

c. 0.5 ml 磷酸钠缓冲液(不存在S9混合物)或 0.5 ml S9(存在 S9 混合液)

d. 0.1 ml 试样或 0.1 ml 阳性或阴性对照

e. 用高压灭菌的蒸馏水补充至 1 毫升。

(6) 将 Eppendorf 管的内容物混合,倒入培养皿中,并使用 L 形涂布器在 MGA 板的表面上涂布。用无菌铝箔覆盖培养皿,以保护测试样品免受光反应物质的影响。

(7)在 37 °C 下孵育 48 小时后,出现自发回复体菌落,肉眼可见。试验重复 3 次。

(8)还原物在培养基的表面和背景上形成了营养缺陷型细菌的均匀菌落。

(9)记录受试物各剂量组的每皿回变菌落数,并求平均值和标准差。

受试物经上述三个试验菌株测定后,只要有一个试验菌株,无论在加 S9 或未加 S9 条件下为阳性,均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经三个试验菌株检测后,无论加 S9 和未加 S9 均为阴性,则可报告该受试物为致突变阴性。

注意事项

1. 由于鼠伤寒沙门氏菌是一种致病细菌,因此每次都采取预防措施并应用标准的生物安全准则;

2.  化学品和菌株的处理应在生物安全柜中进行。在使用前后,必须使用 75% 乙醇对机柜进行消毒,并暴露在 15 分钟的紫外线下;

3.  在丢弃之前,所有受污染的材料(例如,试管、移液器和移液器吸头、防护服和手套)都应正确高压灭菌。

常见问题

1.菌落分布不均匀,集中偏向一侧。

答:倒培养基时平皿未水平放置;

2.如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性。 

答:将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。如果经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中, 而经阳性对照物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,则说明经受试物处理的菌株没有发生突变,试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。

参考来源:Vijay, U., Gupta, S., Mathur, P., Suravajhala, P. and Bhatnagar, P. Microbial Mutagenicity Assay: Ames Test. Bio-protocol, 2018,8(6): e2763. 

来源:丁香实验

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