🔥 划痕实验

在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为「划痕/伤口」，边缘的细胞会逐渐进入空白区域使「划痕/伤口」愈合。

广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

marker 笔、6 孔板、20 µL 枪头、无菌 PBS、无血清或低血清（< 2%）的培养基、37 ℃，5% CO₂ 培养箱、显微镜

1、培养板划线标记

用 marker 笔在 6 孔板背后画横线（用直尺比着），大约每隔 0.5~1 cm 一道，每孔至少横穿 5 条线。

2、细胞铺板

在孔内接种约 5-10×10⁵ 个细胞，根据具体细胞特性调整细胞数量，保证实验时细胞密度近 100% 单层细胞状态。

3、细胞划线

第二天用 20 uL 枪头（灭菌），垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。

4、洗细胞

使用无菌 PBS 洗细胞 2~3 次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清（< 2%）的培养基。

5、细胞培养与观察

将细胞放入 37 ℃，5% CO₂ 培养箱中培养。然后在适当的时间点，如 0，6，12，24 小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。

6、数据分析

使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6 至 8 条水平线，计算细胞间距离的均值。

1、细胞铺板根据细胞的生长快慢调整接种数量，原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀。

2、减少划痕距离的误差办法：不同孔之间最好使用同一只枪头；枪头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺；保持力度一致，尽量一次性划完。

3、在用 PBS 缓冲液冲洗细胞时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞；为了避免细胞数量和状态受到影响，可用移液枪缓慢吸走。

4、孔板选择：因为 6 孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察，故一般选择 6 孔板；当然若是需要高通量初筛时，也可以用 12 或 24 孔板。

5、细胞的接种密度原则一般是过夜为 100% 融合，若过夜后细胞未 100% 融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。

6、降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的方法：

① 使用无血清或低血清培养基（< 2%）可降低细胞增殖对实验结果的影响；

② 一般认为 24 h 为细胞的一个周期，在选取合适的时间点（6，12，24 h）检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；

③ 如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1 μg/ml）处理 1 h，抑制细胞的分裂。

7、确保拍照的观察点固定：按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，划痕一次与 5 条定位线相交，就有 10 个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。