PCR-变性梯度凝胶电泳

PCR-变性梯度凝胶电泳，是把 30~50 个 GC 碱基组成的核苷酸链加在其中一条引物的 5' 端，通过 PCR 扩增目的基因，使扩增产物的一端含有 GC 碱基即 GC-clamp。由于 GC-clamp 为扩增片段中 T_m 值最高的区域，而其它部分因所含碱基的种类不同，其 T_m 值也不同，而且明显低于最高 T_m 值。将带有 GC-clamp 的 DNA 片段放入变性剂（尿素和甲酰胺）呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，当它泳动到一定浓度的变性区域时（此变性剂浓度的变性效果相当于 DNA 片段中最低解链温度区域的 T_m 值），双链 DNA 便发生部分解链。部分解链的 DNA 分子呈分枝状使迁移速度明显减慢，最后几乎处于停顿状态。只要 DNA 片段中有一个碱基发生变异，就会导致碱基间的协同效应，从 而引起 T_m 值的改变，在不同浓度的变性剂水平上发生部分解链而使泳动几乎停止，最终达到检测基因中发生的突变。

PCR-变性梯度凝胶电泳的基本原理是把 30~50 个 GC 碱基组成的核苷酸链加在其中一条引物的 5' 端，通过 PCR 扩增目的基因，使扩增产物的一端含有 GC 碱基即 GC-clamp。由于 GC-clamp 为扩增片段中 T_m 值最高的区域，而其它 部分因所含碱基的种类不同，其 T_m 值也不同，而且明显低于最高 T_m 值。将带有 GC-clamp 的 DNA 片段放入变性剂（尿素和甲酰胺）呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，当它泳动到一定浓度的变性区域时（此变性剂浓度的变性效果相当于 DNA 片段中最低解链温度区域的 T_m 值），双链 DNA 便发生部分解链。部分解链的 DNA 分子呈分枝状使迁移速度明显减慢，最后几乎处于停顿状态。只要 DNA 片段中有一个碱基发生变异，就会导致碱基间的协同效应，从而引起 T_m 值的改变，在不同浓度的变性剂水平上发生部分解链而使泳动几乎停止，最终达到检测基因中发生的突变。

PCR-变性梯度凝胶电泳的常用应用领域如下：

检测人类的基因突变，检测从泥土、新鲜水或盐水中得到的细菌样品的生物多样性，检测肠道细菌群的生物多样性，法医鉴定中的线粒体 DNA 检测，HLA 基因组织分型，基因组差异分析，植物学中家谱分析等方面，更多领域的应用正不断被开发。

器材：PCR 热循环仪、核酸电泳仪、凝胶成像设备、离心机等。

试剂：

① PCR 反应试剂

Tag DNA 聚合酶，缓冲液，引物，dNTP，模板 DNA。

② DGGE 试剂

丙烯酰胺-亚甲基丙烯酰胺（37.5：1），去离子甲酰胺，尿素，过硫酸镂，TEMED，上样缓冲液，TAE 缓冲液（40 mmol/L Tris，20 mmol/L 乙酸，lmmol/L EDTA，pH8.3）。

③染色试剂

EB 染色法试剂：0.5 μg/ml EB。

银染法试剂：甲醇，乙酸，戊二醛，AgNO₃，Na₂CO₃，甲醛，柠檬酸。

PCR-变性梯度凝胶电泳的基本过程可分为如下几步：

1.PCR 扩增目的基因

（1）设计引物：根据待扩增的目的基因设计引物，由于 PCR-DGGE 的特殊要求，即在两个引物中的一个的 5' 端必须带有大约 40 bp 的 GC-clamp。GC-clamp 的设计可有不同的选择，在此推荐两种。

第一种是：5' -GCG GCC GCC CGT CCC GCC GCC CCC GCC CCG CCG CGG CCG-3'。

第二种是：5' -CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC CGC CCG CGC CGC CGC-3'。此 GC-clamp 加在 5' 端引物上。

（2）制备模板根据不同样品釆取不同的方法。

（3）PCR 反应体系

(4)PCR 扩增条件：将 PCR 反应混合液经 94 ℃ 变性 5 min 后，进入 35-40 次循环（94 ℃ 变性 1 min，50~56 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min），最后 72 ℃ 延伸 10 min。

(5) 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，EB 染色鉴定后，纯化，- 20 ℃ 贮存。

2. 变性梯度凝胶电泳

（1）垂直 DGGE 变性剂浓度的确定：由于 DNA 系列是未知的，需进行垂直变性梯度凝胶电泳，以明确目的基因片段和电泳迁移率与变性剂之间的关系。

用凝胶梯度混合仪制备 0~100% 的变性梯度凝胶［100% 的变性剂为 40%（体积分数）的甲酰胺和 7 mol/L 的尿素］，梯度呈线性增加，方向与电泳方向垂直。样品为一端含有 GC 片段的 PCR 产物和等量的上样缓冲液。当变性剂的浓度较低时，不足以使样品中的 DNA 解链，因此条带迁移的速度较快。随着变性剂浓度的增加，样品中的 DNA 分子在变性剂的作用下开始解链，迁移率明显减慢。在样品迁移速度减慢形成的转点时的变性剂浓度即为该样品的最适变性剂浓度。电泳条件为凝胶浓度为 6%。100~200 V 电压电泳大约 4 h，电泳缓冲液的温度控制在 60 ℃。电泳结束后用 EB 染色，紫外检测结果。如图 14-9 所示。

从图 14-9 上可以看出在变性剂浓度从 0 逐渐增加的过程中，电泳的泳动有一个明显减慢的区域，此即为进行平行 DGGE 的变性剂浓度范围。

(2) 水平 DGGE 确定最佳电泳时间为了得到理想的电泳结果，还要选择水平电泳所需的最适时间。从电泳开始，每隔 1 h 顺序加入一份样品（10 μl PCR 产物）。选择后加的样品与先加的样品趋于同一水平所需的最少时间为最适电泳时间。如图 14-10 所示，电泳 5 h 为最佳电泳时间。

(3) 水平 DGGE：根据垂直电泳选择的变性剂浓度范围和水平电泳选择的最佳时间，进行水平变性凝胶电泳，制备变性剂的浓度呈线性梯度增加，方向与电泳的方向一致。

3. 变性梯度凝胶电泳的结果分析

电泳后釆用 EB 染色或银染法染色。分析结果以判定点突变是否发生。可通过基因测序进一步了解突变的结果，如图 14-11 所示。

① 由于使用「GC-clamp」技术可使多数突变落入低温解链区，「GC-clamp」连接在哪一端也非常重要，这将直接影响检测的效果，所以用计算机程序选择最佳引物位置非常重要。仪器公司所出售的仪器中有的带有引物分析软件，只要输入所需的序列，就可以得到所需的引物。

② 用变性梯度凝胶电泳法分析 PCR 产物时，如果突变发生在最先解链的 DNA 区域，检出率可达 100%，检测片段可达 1 kb，最适范围为 100~500 bp。如果用恒变性剂毛细管电泳法进行分离，这时可以从 3000 bp 长的片段中检测出突变分子。根据实验室条件的不同，选择合适的检测手段。可先通过 PCR 扩增出大片段中的一部分进行，然后再进行叠加筛选。

③ 用两个引物对基因组 DNA 进行扩增，一个引物的 5' 端连以 40~45 bp 富含 GC 的一段序列。因为必须有异源双链形成才能保证检出率接近 100%，但由于可能形成突变纯合子，所以必须加入等物质的量的正常 DNA 分子，以在分析前形成异源双链。

④ 应用「GC-clamp」变性梯度凝胶电泳技术研究某些基因时，如基因中含有较高的 GC 碱基（70%），由于 CpG 区是突变热点，不宜用 DGGE 进行筛查，所以必须用单链构象多态性技术进行大量的筛查。对用带有 GC-clamp 的异源双链变性梯度凝胶电泳分析所遇到的假阴性问题比较难以找到准确的原因，应该注意到可能会检测出甲基化的碱基。所以最后必须进行测序以确定检测到的是否是真正的突变碱基。

⑤ DGGE、TGGE 均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作较简便，适合于大样本的检测筛选。