L-DNA标记的等位基因特异性PCR

L-DNA 标记的等位基因特异性 PCR，是将等位基因特异性 PCR 与 L-DNA 标记的 PCR 结合起来。L-DNA 标记的 PCR 扩增的 DNA 是带有序列确定的 L-DNA 标签。L-DNA 是自然存在的 D-DNA 的对映体，由 L-2' 脱氧核昔酸组成。单链 L-DNA 能够与 L-DNA 互补，但不与 D-DNA 互补，由于大分子的手性，自然界的酶如核酸酶、聚合酶也不能对 L-DNA 起作用。因为 Taq DNA 聚合酶在 L-DNA 模板尚不能合成，PCR 反应之后，L-DNA 标记的引物产生的 PCR 产物带有 L-DNA 黏末端，通过表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）成像分析进行 SNP 分型，适用于高通量筛选。

L-DNA 标记的等位基因特异性 PCR 的基本原理同等位基因特异性 PCR 相同，两条上游引物，分别在 3' 端含有不同的等位基因，和一条共同的下游引物。所不同的是两条上游引物的 5' 端含有不同的 L-DNA 序列。在图 14-5 中，引物中 5' 端不同的阴影表示不同的 L-DNA 序列，黑色部分代表与靶序列配对的 DNA， 这些引物与不同的模板反应，例如野生型纯合子（WT homozygote）、杂合子（heterozygote）、突变型纯合子 （MU homozygote），会得到不同数量的含 有不同 L-DNA 的 PCR 产物，通过与 SPR 芯片上的互补 L-DNA 序列结合，便可检测到不同的 PCR 产物。

器材：PCR 扩增仪、用于琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂及仪器、SPR 芯片及相关仪器（SPR-101 TOYOBO，Japan）。

试剂：

① 模板：基因组 DNA 或血清。

② dNTP 混合液：每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L。

③ 三条特异引物：浓度均为 10 μmol/L。两条上游引物 5' 端含有 L-DNA 序列，下游引物为常用 DNA 序列。

④ 分别针对不同 L-DNA 的 3' 端含硫的 L-DNA 互补序列。

⑤ L-脱氧（核糖）核昔亚磷酰胺（A、G、C 和 T），用于合成 L-DNA。

⑥ TaqDNA 聚合酶及 10 × PCR 缓冲液：15 mmol/L MgCL₂，500 mmol/L KCI，100 mmol/L Tris-Cl，0.1%（体积分数）Triton X-100。

⑦ 髙压灭菌去离子水。

L-DNA 标记的等位基因特异性 PCR 的基本过程可分为如下几步：

1. 模板

利用试剂盒提取的基因组 DNA。

2. 引物设计

根据已知的等位基因突变，将引物的 3' 末端设计在恰好可能发生突变的位置。其中一条正向引物可以与野生型等位基因 1 片段完全互补（3' 末端与突变型等位基因 2 不匹配），另一条正向引物与突变型等位基因 2 片段完全互补（3' 末端与野生型等位基因 1 不匹配），反向引物设计在较为保守的区域内，扩增的片段通常在 300 bp 以内。两条正向引物的 5' 端分别含有一部分由 L-DNA 组成的序列，长度为 20~30 bp 左右，与模板互补的序列部分长 20 bp 左右，在引物的倒数第三个碱基引入一个内部错配，以阻止末端错配引物的扩增，引物的总长度为 40~50 bp。还需合成两条完全由 L-DNA 组成的序列，与引物上 L-DNA 的序列互补，固定于 SPR 芯片表面。

3. 操作方法

（1）设立 50 μl 的 PCR 反应体系至少配制两管反应液，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入以下成分。

注：L1-MU 表示突变型等位基因特异的引物；L2-WT 表示野生型等位基因特异的引物；RV 表示下游引物。

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

（2）设置 PCR 反应条件

（3）PCR 产物的检测和分析：PCR 产物可以直接利用 PAGE 电泳（10% PAGE，漠酚蓝染色）进行检测。

对于高通量检测，可使用基于 SPR 仪器的芯片检测方法。首先要制备标有 L-DNA 的芯片。将 200 μl 溶于乙醇中的 lmmol/L 8-氨基-正辛硫醇滴加到金表面上，反应 7 h，再用乙醇和去离子水洗过之后，经氨烷基修饰过的表面与 200 μl 5 mg/ml 的 MAL-PEG12-NHS 酯反应 2 h，这是一个异源双功能的连接子，能产生马来酰亚胺修饰的表面。使用自动点样机将 10 滴 20 μmol/L 的 L-DNA 点到马来酰亚胺表面。马来酰亚胺-硫的偶合反应过夜进行，芯片表面进一步与 200 μl 2 mg/ml 的 PEG 硫反应 2 h，以阻断剩余的马来酰亚胺基团，之后，芯片表面使用磷酸缓冲液（10 mmol/L 磷酸，150 mmol/L NaCl，pH7.2）和水冲洗。

将标有 L-DNA 的金芯片置于 SPR 成像系统上，将表面用 10 mmol/L NaOH 洗 2 min 后，上磷酸缓冲液（10 mmol/L 磷酸，150 mmol/L NaCh pH7.2）5 min，在检测之前，将两个 L-DNA 标记的等位基因特异性 PCR 产物混合，加到 L-DNA SPR 芯片上，进行 SPR 显像分析时，加入缓冲液 100 s 后，将芯片暴露于 PCR 产物 10 min，流速为 10 μl/min，在成像之前芯片表面用缓冲液冲洗 5 min。本部分所有操作均在 30℃ 进行。再用 0.5mol/L NaOH 清洗 3 min 后，芯片可以重复使用。收集 SPR 图像和信号数据。

① PCR 反应的相关注意事项见等位基因特异性 PCR，二者的操作原理一样，因此注意事项也相同。

② L-DNA 序列不能影响 PCR 扩增效率。

③ 在进行 SPR 图像分析时，由于未结合的 L1-MU 或 L2-WT 存在，会有非特异结合产生，在分析时要将背景值减去。