等位基因特异性PCR

等位基因特异性 PCR，也称错配 PCR（mismatch PCR）， 扩增耐突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）， 错配扩增突变分析（mismatch amplification mutation assay，MAMA），是相较单链构象多态性分析（single stnmd conformation polymorphism，SSCP）、限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、异源双链分析（heteroduplexanalysis，HA）更为简便、快速，易于检测大量标本的 PCR 方法。

等位基因特异性 PCR 的基本原理是，Taq DNA 聚合酶缺少外切酶活性，在一定条 件下，PCR 引物 3' 末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物， 可以通过 PCR 方法直接达到区分突变型与野生型基因的目的。该方法要求制备 3 个 PCR 引物， 其中 2 个引物分别含有待测 DNA 中突变位点的突变碱基及正常碱基，另外一个为正常对侧引 物。当分别经过 PCR 扩增后，正常引物仅将正常 DNA 扩增出，而含突变碱基的引物将突变 DNA 链扩增出，然后用普通琼脂糖凝胶电泳检测有无扩增产物。

根据基因组已知的突变区及保守区，设计出三条引物，其中上游引物设计 2 条，其区别仅为 3' 末端的碱基不同，一个为等位基因 1 特异的引物（ASP1， 3' 末端为 A），另一个为等位基因 2 特异的引物（ASP2， 3' 末端为 C），下游引物（CON）设计在相对保守的位置。然后对于含有等 位基因 1 和等位基因 2 的基因组，分别用 ASP1. ASP2 与下游保守引物（CON）配对进行 PCR， 反应条件相同。再后进行结果检测。当用等位基因 1 DNA 为模板时，用 ASP1 与下游保守引物（CON）配对进行 PCR 得到了有效扩增，而用 ASP2 与下游保守引物（CON）配对进行 PCR 则 无扩增；当用等位基因 2DNA 为模板时，用 ASP2 与下游保守引物（CON）配对进行 PCR 得到 了有效扩增，而用 ASP1 与下游保守引物（CON）配对进行 PCR 则无扩增。

器材：PCR 扩增仪。

试剂：

① 模板：基因组 DNA 或血清。

② dNTP 混合液：每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L。

③ 三条特异引物：浓度均为 10pimol/L。

④ Taq DNA 聚合酶。

⑤ 10 × PCR 缓冲液：15 mmol/L MgCl₂，500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-Cl，0.1%（体积分数）Triton X-100。

⑥ 高压灭菌去离子水。

⑦ 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

等位基因特异性 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

这是等位基因特异 PCR 最为重要的一个环节。根据已知的等位基因突变，将引物的 3' 末端设计在恰好可能发生突变的位置。其中一条引物可以与等位基因 1 片段完全互补（3' 末端与等位基因 2 不匹配），另一条引物与等位基因 2 片段完全互补（3' 末端与等位基因 1 不匹配），反向引物设计在较为保守的区域内，扩增的片段通常在 300 bp 以内。（见注意事项 ②）

（二）模板

一般使用经过提取的基因组 DNA（约 50 ng），也有使用血样纸片的报道。

（三）操作方法

1. 设立 50 μl 的 PCR 反应体系，至少配制两管反应液，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入以下成分。

注：ASP1：等位基因 1 特异的引物；ASP2：等位基因 2 特异的引物：CON：下游引物。

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

2. 设置 PCR 反应条件

3. PCR 产物的检测和分析：反应结束后，用 10 μl 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。若试验成功，含有等位基因 1、2 的引物应当分别在其相应的模板上有扩增。

也可以用较为复杂的检测方法来进行分析，王瑞恒等将 PCR 产物经 ABI Prism™ 310 Ge-netic Analyzer 电泳分离。取 1 μl PCR 产物，加至 12 μl 甲酰胺中，再加入 0.5 μl GeneScan™ Size Standards LIZ-500（橙色）作为内标，毛细管电泳 25 min.（1.5kV，POP4 凝胶，47 cm 毛细管）。电泳结束后，用 GeneScan™ V3.0 分析。根据产物长度和产物峰的数量进行 SNP 分型，确定每个 SNP 位点的基因型。

① 在等位基因特异性 PCR 中，如何来控制假阳性产物的出现是一个很关键的问题。通常先 从 PCR 的反应体系及反应条件入手，采取的方法有降低 PCR 反应的 Taq 酶量、引物浓度、 dNTP 浓度，提高退火温度等。每次反应的最适条件需通过几次不同的预实验来确定最佳组合。

② 引物设计时，要注意错配的位置必须在引物 3' 的最后一个碱基，否则将导致不能很好地 判断突变是否发生。偶尔，引物 3' 末端的错配不足以达到预期的分辨水平，特别是当突变型对野 生型的比例较低时更是如此，此时，在 3' 末端的倒数第二或第三个碱基处人为地引入错配，可以 很明显地提高分辨率。

③ 通常，在等位基因特异性 PCR 中，仅使用一对引物容易产生假阴性结果，将多重 PCR 方 法引入，及在所需扩增的 PCR 产物的外围再设计一对或一条引物，可作为内部的阳性对照，避 免假阴性结果的产生。