荧光共振能量转移的流式细胞分析

通过多种方法检测体内外分子间相互作用，使得对细胞各种生命过程的研究更加方便。一种用来研究与活细胞动态生命过程有关的、分子间相互作用的非常有价值的工具，就是利用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）现象，加上使用选择性荧光素耦联的靶分子。许多报告都利用了荧光团耦合抗体用于 FRET 分析。然而，这些方法都局限于细胞外分子且必须有合适的抗体。目前，适合 FRET 的绿色荧光蛋白（GFP）变体的发展扩展了此种方法的使用范围，不仅能用于细胞外也能用于细胞内分子过程的研究。FRET 与流式细胞分析技术的结合，使得对分子间相互作用的研究可以高通量高效率地进行。

荧光共振能量转移的流式细胞分析的原理是通过构建 GFP 变异体的融合蛋白，且将它们转入适当的细胞体系中，此细胞体系可以通过流式细胞术监测活细胞中不同生物机制的分子间相互作用。FRET 分析与流式细胞术结合使用将更有利于研究者在短时间内筛选大量的细胞。

器材：

① 6 ml FACS 分选管（Falcon）。

② FACSVantage SE 流式细胞仪（BD Biosciences，圣何塞，加州）（见小标题 3.3.3．）。

③ FlowJo 分析软件（Tree Star，Inc.，圣卡洛斯，加州）或其他流式细胞术分析软件。

④ 离心机

试剂：

① 质粒：pEF6-myc-HisB（Invitrogen，卡尔斯巴德，加州），pECFP-N1，pEYFP-N1（BD Biosci-ences Clontech，帕洛阿尔托，加州）。

② p80 TNFR-2，TRAF2 和 SODD（孔之结构沉默子）的 cDNA。

③ PCR 寡核苷酸引物。

④ 限制酶，T4DNA 连接酶。

⑤ QIAEX 凝胶纯化试剂盒（Qiagen，瓦伦西亚，加州）。

⑥ 转化用活跃的 E. coli 细胞（如，XL-1 蓝色-Stratagene，拉霍亚、加州）。

⑦ HEK 293T 细胞。

⑧ 完整的 Dulbecco's 改良的 DMEM：不带酚红的 DMEM，10％ 胎牛血清（FCS），100 单位青霉素和链霉素，和 2 mM L-谷氨酰胺。

⑨ FuGENE 6（Roche Applied Science，印第安纳波利斯，印第安纳州）。

⑩ 磷酸缓冲液（PBS）。

⑪ 诺乃洗涤剂（NP-40）：10 mM Tris-HCl，pH7.5,150 mM NaCI，和 1％ NP-40。

⑫ Bio-Rad 蛋白检测试剂（Bio-Rad 实验室，赫尔克里士，加州）。

⑬ 10％ Bis-Tris NuPA 蛋白凝胶（Invitrogen）。

⑭ 兔子多克隆抗 TRAF2 血清（Santa Cruz Biotechnology，圣克鲁兹，加州）。

⑮ 500 μg/ml PI 溶液。

荧光共振能量转移的流式细胞分析的基本过程可分为如下几步：

1 结构设计

1.1 载体和 CFP 及 YFP 载体的构建

1.1.1 为 CFP 和 YFP cDNA 的插入设计 PCR 引物。

1.1.2 以 pECFP-N1 或 pEYFP-N1 模板进行 PCR。

1.1.3 1％ 的琼脂糖凝胶上电泳分离 PCR 产物。将正确的片段切下，并用 QIAEX 纯化。

1.1.4 用以下内切酶酶切 PCR 片段：

（1）BamHI/EcoRV（YFP 片段）。

（2）EcoRV/Xbal（CFP 和 YFP 片段）。

1.1.5 用以下内切酶酶切 pEF6-myc-HisB 载体：

(1)BamHI/EcoRV

(2)EcoRV/Xbal。

1.1.6 用来自 5 a 的带菌者固定得到的片段。将片段和载体连起来，构建 pEF6B-YFP-C 质粒。同时将来自于步骤 4 b 的 CFP 或 YFP 片段和步骤 5 b 的载体连起来，构建 pEF6B-CFP-N 和 pEF6B-CFP-N 质粒。

1.1.7 将质粒转化感受态细菌 XL-1-blue 菌株。

1.1.8 小量制备质粒，筛查获得的克隆中 PCR 产物是否插入。

1.1.9 小量制备 DNA 质粒，测序确定插入序列的完整性。

1.2 cDNA 克隆

1.2.1 PCR 扩增 p80 TNFR-2，TRAF2 和 SODD 的 cDNA。

1.2.2 用 BamHI/EcoRV 酶切 p80 PCR 产物。用 EcoRV/Xbal 酶切 TRAF2 和 SODD PCR 产物。

1.2.3 用 EcoRV/Xbal 酶切 pEF6B-YFP-C。将步骤 2 的产物 TRAF2 和 SODD cDNA 连接插入，构建 pEF6B-YFP-TRAF2 和 pEF6B-YFP-SODD 载体。

1.2.4 用 BamHI/EcoRV 酶切 pEF6B-CFP-N 和 pEF6B-YFP-N。将步骤 2 的产物 p80 片段连接插入，构建 pEF6B-p80-CFP 和 pEF6B-p80-YFP。

1.2.5 重复以上步骤。

2 表达载体的鉴定

2.1 293T 细胞中转染

2.1.1 12 孔板中每孔接种 2.5 × 105 个细胞及 1 ml 的完全 DMEM 培养基，37 ℃ 孵育 16~20 h。

2.1.2 用 6 μl FuGENE 6 转染每个质粒 2 μg 到 HEK 293T 细胞，DNA/FuGENE 6 的比值为 1：3。

2.1.3 37 ℃ 条件下生长并孵育 24~48 h。

2.1.4 收获细胞用作后续的 Western blotting 或流式分析。

2.2 Western Blotting 分析

2.2.1 从孔中吸去培养花，每孔加入 1 ml PBS。在 PBS 中轻轻的重悬细胞且将细胞悬液转移到离心管中。

2.2.2 480 g 离心细胞 5 min。吸去 PBS。

2.2.3 100 μl NP-40 裂解液中重悬细胞，冰上孵化 15 min。

2.2.4 4 ℃、17 900 g 高速冷冻离心机中离心 10 min。

2.2.5 转移上清至新鲜的离心管中。用 Bio-Rad 蛋白检测试剂盒测蛋白浓度。

2.2.6 加 50 μg 细胞裂解后的蛋白提取物至 10％ Bis-Tris NuPAGE 凝胶，并转移到硝基纤维膜上。

2.2.7 用抗 TRAF2 抗体和 HRP-耦联的杂交抗兔子 IgG 的二抗。图 15-2 显示了 HEK 293T 细胞中 YFP-TRAF2（泳道 2）和未标记的 TRAF2（泳道 3）的表达（见注释 4.4）。

2.3 监测已表达蛋白的荧光作为 Western blot 检测的替代方法，转染质粒表达的细胞也可通过流式细胞监测。

2.1 含 2％ FCS 的 PBS 1 ml 洗涤细胞 2 次，4 ℃，480 g 离心过滤 5 min。

2.2 含 2％ FCS 的 PBS 1 ml 中重悬细胞。

2.3 加 2 μl PI 溶液（500 μg/ml）到细胞悬液中。

2.4 流式细胞仪上样分析。

3 进行 FRET 流式细胞术分析

1、转染

转染程序如上所述，使用 FuGENE6 进行。

2、细胞收获

2.1 24~48 h，用含 2％ FCS 的 PBS 离心洗涤细胞 2 次，收获细胞。

2.2 重悬细胞于含 2％ FCS 的 PBS 中。

2.3 细胞先通过尼龙筛过滤后分析。

2.4 上机检测前一直保持细胞在 4 ℃，如果需要对细胞样本进行进一步操作（比如配合体刺激），可以在室温下保存。

3、流式细胞仪检测

在 FACS Vantage SE 流式细胞仪上分析细胞。FACS Vantage SE 使用双激光；一个 ILT 气冷的氩激光器和一个装备紫光的氪激光器（Spectra-Physics model 2 060，Spectra-Physics，山景市，加州）。氩激光器调至 514 nm 直接激发 YFP。氪激光器调至 513 nm 用于激发 CFP。前向（FSC）和侧向（SSC）滤光片以 513/10 nm 带通滤光片（BP）取代。CFP 荧光在 FL5 用 470/20 nm 的 BP 滤光片检测（P6）。505 长通分光棱镜（DM）用来分开 CFP 荧光和 FRET 来自激光 2 的激发光。FRET 信号在 FL4 用 546/10 nm BP 滤光片检测（P5）。FL1（P3）通道中用 546/10 nm BP 滤光片直接检测 YFP 荧光，但是被导向 P7 通道，这样可以用 Omnicomp 选项进行 P5-P7 间的荧光补偿调节。样品采集时液压应定在每平方英寸（psi）30 磅的压力，这样做可以缩短氩激光器和氪激光器间的脉冲定时，以便用标准的延迟模式进行激光间补偿调节，最大延迟时间为 17.5μs。在检测前加 1 mg/ml 的 PI，收集 50000 个活细胞。

4 FlowJo 分析数据

4.1 通过 SSC/FSC 或 PI/FSC（P8 中检测）散点图设定活细胞门。

4.2 以活细胞门建立 CFP（FL5/P6）荧光和 FRET（FL4/P5）的二维散点图。

4.3 使用载体转染的样本作为阴性对照设置 CFP 阳性和 CFP 阴性群体间的 cutoff 值。从而固定 CFP 阳性门。

4.4 用 CFP 阳性门内的细胞作柱状图对 FRET 荧光强度进行分析。

4.5 用 p80-CEP 作为阴性对照，作 FRET 柱状重叠图。在样本 2 柱状图上重叠的来自样本 6，7 或 8 的柱状图。表达 p80-CFP 和 p80-YFP（样品 6）产生很强的 FRET 信号。p80-CFP 和 YFP-TRAF2（样本 7）共表达同样也导致了强 FRET 信号。然而，当与 p80-CFP 无相互作的对照 YFP-SODD 共转染时，不能产生任何的与 p80-CFP 相互作用的（样本 8）有意义的 FRET 信号。